蛋白質(zhì)的檢測(cè)、鑒定及回收
檢測(cè)蛋白質(zhì)最常用的染色劑是考馬斯亮藍(lán)R-250(CBB,Coomassie brilliant blue),通常是用甲醇:水:冰醋酸(體積比為45:45:10)配制0.1%或0.25%(W/V)的考馬斯亮藍(lán)溶液作為染色液。這種酸-甲醇溶液使蛋白質(zhì)變性,固定在凝膠中,防止蛋白質(zhì)在染色過程中在凝膠內(nèi)擴(kuò)散,通常染色需2小時(shí)。脫色液是同樣的酸-甲醇混合物,但不含染色劑,脫色通常需過夜搖晃進(jìn)行??捡R斯亮藍(lán)染色具有很高的靈敏度,在聚丙烯酰胺凝膠中可以檢測(cè)到0.1 g的蛋白質(zhì)形成的染色帶。考馬斯亮藍(lán)與某些紙介質(zhì)結(jié)合非常緊密,所以不能用于染色濾紙、醋酸纖維素薄膜以及蛋白質(zhì)印跡(在硝化纖維素紙上)。在這種情況下通常是用10%的三氯乙酸浸泡使蛋白質(zhì)變性,而后使用不對(duì)介質(zhì)有強(qiáng)烈染色的染料如溴酚藍(lán)、氨基黑等對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。
銀染是比考馬斯亮藍(lán)染色更靈敏的一種方法,它是通過銀離子(Ag+)在蛋白質(zhì)上被還原成金屬銀形成黑色來指示蛋白區(qū)帶的。銀染可以直接進(jìn)行也可以在考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行,這樣凝膠主要的蛋白帶可以通過考馬斯亮藍(lán)染色分辨,而細(xì)小的考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不到的蛋白帶由銀染檢測(cè)。銀染的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色高100倍,可以檢測(cè)低于1 ng的蛋白質(zhì)。
糖蛋白通常使用過碘酸-Schiff試劑(PAS)染色,但PAS染色不十分靈敏,染色后通常形成較淺的紅-粉紅帶,難以在凝膠中觀察。目前更靈敏的方法是將凝膠印跡后(下面介紹)用凝集素檢測(cè)糖蛋白。凝集素是從植物中提取的一類糖蛋白,它們能識(shí)別并選擇性的結(jié)合特殊的糖,不同的凝集素可以結(jié)合不同的糖。將凝膠印跡用凝集素處理,再用連接辣根過氧化物酶的抗凝集素抗體處理,然后再加入過氧化物酶的底物,通過生成有顏色的產(chǎn)物就可以檢測(cè)到凝集素結(jié)合情況。這樣凝膠印跡用不同的凝集素檢測(cè)不僅可以確定糖蛋白,而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。
通過掃描光密度儀對(duì)染色的凝膠進(jìn)行掃描可以進(jìn)行定量分析,確定樣品中不同蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。掃描儀測(cè)定凝膠上不同遷移距離的吸光度值,各個(gè)染色的蛋白帶形成對(duì)應(yīng)的峰,峰面積的大小可以代表蛋白質(zhì)的含量的多少。另外一種簡(jiǎn)單的方法是將染色的蛋白帶切下來,在一定體積的50%吡啶溶液中搖晃過夜溶解染料,而后通過分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值就可以估算蛋白質(zhì)的含量。但應(yīng)注意,蛋白質(zhì)只有在一定的濃度范圍內(nèi)其含量才與吸光度值成線性關(guān)系,另外不同的蛋白質(zhì)即使在含量相同的情況下染色程度也可能有所不同,所以上面的方法對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定只能是一種半定量的結(jié)果。
盡管凝膠電泳通常是作為一種分析工具使用,它也可以用于蛋白質(zhì)的純化制備。但電泳后需將蛋白質(zhì)從凝膠中回收,通常是將所需的蛋白質(zhì)區(qū)帶部分的凝膠切下,通過電泳的方法將蛋白質(zhì)從凝膠中洗脫下來(稱為電洗脫)。目前有各種商品電洗脫池裝置。最簡(jiǎn)單的方法是將切下的凝膠裝入透析袋內(nèi)加入緩沖液浸泡,再將透析袋浸入緩沖液中進(jìn)行電泳,蛋白質(zhì)就會(huì)向某個(gè)電極方向遷移而離開凝膠進(jìn)入透析袋內(nèi)的緩沖液。由于蛋白質(zhì)不能通過透析袋,所以電泳后蛋白質(zhì)就留在透析袋的緩沖液中。電洗脫后可通一個(gè)反向電流,持續(xù)幾秒鐘,使吸附在透析袋上的蛋白質(zhì)進(jìn)入緩沖液,這樣就可以將凝膠中的蛋白質(zhì)回收。