等電聚焦電泳是根據(jù)兩性物質(zhì)等電點（pI）的不同而進行分離的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等電點相差0.01的蛋白質(zhì)，是分離兩性物質(zhì)如蛋白質(zhì)的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過加入兩性電解質(zhì)形成一個pH梯度，兩性物質(zhì)在電泳過程中會被集中在與其等電點相等的pH區(qū)域內(nèi)，從而得到分離。

兩性電解質(zhì)是人工合成的一種復雜的多氨基－多羧基的混合物。不同的兩性電解質(zhì)有不同的pH梯度范圍，既有較寬的范圍如pH＝3～10，也有各種較窄的范圍如pH＝7～8。要根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當?shù)膬尚噪娊赓|(zhì)，使待分離樣品中各個組分都在兩性電解質(zhì)的pH范圍內(nèi)，兩性電解質(zhì)的pH范圍越小，分辨率越高。

等電聚焦多采用水平平板電泳，也使用管式電泳。由于兩性電解質(zhì)的價格昂貴，使用1～2 mm厚的凝膠進行等電聚焦價格較高。使用兩條很薄的膠帶做為玻璃板間隔，可以形成厚度僅0.15 mm的薄層凝膠，大大降低成本，所以等電聚焦通常使用這種薄層凝膠。由于等電聚焦過程需要蛋白質(zhì)根據(jù)其電荷性質(zhì)在電場中自由遷移，通常使用較低濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如4％）以防止分子篩作用，也經(jīng)常使用瓊脂糖，尤其是對于分子量很大的蛋白質(zhì)。制作等電聚焦薄層凝膠時，首先將兩性電解質(zhì)、核黃素與丙烯酰胺貯液混合，加入到帶有間隔膠條的玻璃板上，而后在上面加上另一塊玻璃板，形成平板薄層凝膠。經(jīng)過光照聚合后，將一塊玻璃板橇開移去，將一小薄片濕濾紙分別置于凝膠兩側(cè)，連接凝膠和電極液（陽極為酸性如磷酸溶液，陰極為堿性如氫氧化鈉溶液）。接通電源，兩性電解質(zhì)中不同的等電點的物質(zhì)通過電泳在凝膠中形成pH梯度，從陽極側(cè)到陰極側(cè)pH值由低到高呈線性梯度分布。而后關(guān)閉電源，上樣時取一小塊濾紙吸附樣品后放置在凝膠上，通電30 min后樣品通過電泳離開濾紙加入凝膠中，這時可以去掉濾紙。最初樣品中蛋白質(zhì)所帶的電荷取決于放置樣品處凝膠的pH值，等電點在pH值以上的蛋白質(zhì)帶正電，在電場的作用下向陰極移動，在遷移過程中，蛋白質(zhì)所處的凝膠的pH值逐漸升高，蛋白質(zhì)所帶的正電逐漸減少，到達pH＝pI處的凝膠區(qū)域時蛋白質(zhì)不帶電荷，停止遷移。同樣，等電點在上樣處凝膠pH以下的蛋白質(zhì)帶負電，向陽極移動，最終到達pH＝pI處的凝膠區(qū)域停止?？梢姷入娋劢惯^程無論樣品加在凝膠上什么位置，各種蛋白質(zhì)都能向著其等電點處移動，并最終到達其等電點處，對最后的電泳結(jié)果沒有影響。所以有時樣品可以在制膠前直接加入到凝膠溶液中。使用較高的電壓（如2000V，0.5mm平板凝膠）可以得到較快速的分離（0.5～1小時），但應注意對凝膠的冷卻以及使用恒定功率的電源。凝膠結(jié)束后對蛋白質(zhì)進行染色時應注意，由于兩性電解質(zhì)也會被染色，使整個凝膠都被染色。所以等電聚焦的凝膠不能直接染色，要首先經(jīng)過10％的三氯乙酸的浸泡以除去兩性電解質(zhì)后才能進行染色。

等電聚焦還可以用于測定某個未知蛋白質(zhì)的等電點，將一系列已知等電點的標準蛋白（通常pI在3.5～10之間）及待測蛋白同時進行等電聚焦。測定各個標準蛋白電泳區(qū)帶到凝膠某一側(cè)邊緣的距離對各自的pI值作圖，即得到標準曲線。而后測定待測蛋白的距離，通過標準曲線即可求出其等電點。

等電聚焦具有很高的靈敏度，特別適合于研究蛋白質(zhì)微觀不均一性，例如一種蛋白質(zhì)在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一帶，而在等電聚焦中表現(xiàn)三條帶。這可能是由于蛋白質(zhì)存在單磷酸化、雙磷酸化和三磷酸化形式。由于幾個磷酸基團不會對蛋白質(zhì)的分子量產(chǎn)生明顯的影響，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一帶，但由于它們所帶的電荷有差異，所以在等電聚焦中可以被分離檢測到。同功酶之間可能只有一兩個氨基酸的差別，利用等電聚焦也可以得到較好的分離效果。由于等電聚焦過程中蛋白質(zhì)通常是處于天然狀態(tài)的，所以可以通過前面介紹的活性染色的方法對酶進行檢測。等電聚焦主要用于分離分析，但也可以用于純化制備。雖然成本較高，但操作簡單、純化效率很高。除了通常的方法，制備性等電聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或顆粒狀凝膠如Sephadex G-75中進行。