銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長(zhǎng)棒形的細(xì)菌。銅綠假單胞菌是一種主要致病菌，患囊腫性纖維化、燒傷、獲得性免疫缺陷綜合癥和癌癥的住院病人易嚴(yán)重感染本菌。銅綠假單胞菌最令人擔(dān)憂的一點(diǎn)是極易產(chǎn)生耐藥性，這是由于抗生素耐藥基因（如mexAB、mexXY等）能編碼多重耐藥泵，以及菌的膜通透性低。由于多重耐藥（MDR）、廣泛耐藥（XDR）和泛耐藥（PDR）的菌株不斷涌現(xiàn)，這給抗菌治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。大量的研究聚焦于銅綠假單胞菌感染機(jī)制的分子基礎(chǔ)和開(kāi)發(fā)防治感染的新方法。同時(shí)，銅綠假單胞菌是生物膜形成、群體感應(yīng)、藥物靶點(diǎn)和代謝工程研究的模式生物。

銅綠假單胞菌的研究熱點(diǎn)

基于CRISPR/Cas 9的基因組編輯將加速對(duì)銅綠假單胞菌的多功能研究。

基因組、蛋白質(zhì)組和生物學(xué) | 細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和維持 | 耐藥性 | ? ? ? ? 分泌系統(tǒng) | ? ? ? ? ?細(xì)胞極性和上皮屏障

CRISPR-B? 高效編輯銅綠假單胞菌

基因編輯通常會(huì)徹底改變對(duì)微生物物種的理解、開(kāi)發(fā)和控制。銅綠假單胞菌是生物膜形成、群體感應(yīng)、藥物靶點(diǎn)和代謝工程研究的模式生物。然而，傳統(tǒng)的銅綠假單胞菌遺傳操作方法需要多步選擇才能產(chǎn)生突變體，并在缺失基因的地方留下疤痕序列。因此，傳統(tǒng)的方法仍費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

源井生物研發(fā)的CRISPR-B?可高效編輯銅綠假單胞菌的基因。利用CRISPR/Cas9和λ-Red重組系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌快速、精確、無(wú)縫的基因編輯操作。源井生物可以定制銅綠假單胞菌的基因編輯，以及微生物中的各種基因修飾。

使用CRISPR/Cas9對(duì)微生物進(jìn)行基因編輯，助力抗菌藥物開(kāi)發(fā)

硝酸鎵（Ganite）是治療銅綠假單胞菌感染的潛在藥物。基于CRISPR/Cas9的基因突變研究表明，鐵載體pyochelin介導(dǎo)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是銅綠假單胞菌Ga3+內(nèi)化的兩個(gè)主要途徑。研究者揭示了Ga3+能抑制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和生物膜形成。

硝酸鎵能改善CF和慢性銅綠假單胞菌肺部感染患者的肺功能，且無(wú)任何嚴(yán)重不良反應(yīng)，該結(jié)果顯示硝酸鎵具有治療銅綠假單胞菌感染的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

為了研究銅綠假單胞菌攝取鎵的分子機(jī)制，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)銅綠假單胞菌模型菌株P(guān)AO1中的關(guān)鍵基因進(jìn)行突變，以分別阻斷鐵的吸收途徑。研究中共構(gòu)建了5個(gè)不同的PAO1突變體，（1）PAO1ΔhitA突變體阻斷經(jīng)典的高親和力鐵吸收系統(tǒng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，兩個(gè)突變體（2）PAO1ΔpvdA和（3）PAO1ΔpchF分別阻斷了兩個(gè)鐵載體PVD和PCH的生物合成途徑，（4）PAO1ΔfeoB突變體失去了高親和力的內(nèi)膜鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，（5）PAO1Δtesf突變體取消了Tesf介導(dǎo)的鐵吸收途徑。

研究人員通過(guò)測(cè)定在缺鐵培養(yǎng)基中Ga(NO3)3對(duì)不同菌株的最低抑菌濃度（MICs），分析Ga（III）對(duì)野生型（WT）和不同PAO1突變體生長(zhǎng)的影響。他們還分析了不同的鐵吸收途徑對(duì)PAO1和PAO1Δtesf突變體攝取鎵的影響。在這個(gè)雙突變株中也觀察到細(xì)胞內(nèi)鐵水平的顯著下降（圖3B），這表明HitABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是銅綠假單胞菌鐵攝取的主要貢獻(xiàn)者。

HitA是一種存在于細(xì)菌周質(zhì)中的可溶性鐵結(jié)合蛋白，與單個(gè)Fe3+具有很高的親和力。HitA在Ga3+攝取過(guò)程中也有類似的作用。為了揭示這一現(xiàn)象，他們應(yīng)用細(xì)胞熱位移分析（CETSA）觀察到Ga3+可以在體內(nèi)與HitA結(jié)合。隨后，他們進(jìn)行了金屬競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，觀察到Fe3+可以很容易地從Ga3+-HitA蛋白中取代Ga3+。研究人員生成了apo-HitA和Fe3+結(jié)合以及Ga3+結(jié)合的HitA蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。Ga3+-HitA的結(jié)構(gòu)與Fe3+-HitA相似，F(xiàn)e3+的配位球與Ga3+位點(diǎn)上確定的幾乎相同，因此證實(shí)Ga3+可以模仿Fe3+占據(jù)HitA的金屬結(jié)合位點(diǎn)。

本研究為銅綠假單胞菌內(nèi)化Ga3+提供分子機(jī)制，促進(jìn)了鎵類抗菌藥物的開(kāi)發(fā)。

源井生物自主研發(fā)的CRISPR-B?技術(shù)優(yōu)化了微生物基因編輯載體及過(guò)程。其效率和準(zhǔn)確度是傳統(tǒng)方法的20多倍。該技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的基因編輯。

參考文獻(xiàn)：

Identification and characterization of a metalloprotein involved in gallium internalization in Pseudomonas aeruginosa. ACS Infect Dis 2019, 5(10):1693-1697.

Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front Microbiol 2012, 3:20

作者 | By Dr. ASAD UZZAMAN

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