KRAS抑制劑篩選---核苷酸交換法
01背? 景
RAS屬于一類(lèi)小 GTP酶家族。像大多數(shù)小 GTP酶一樣，KRAS在其非活性形式中結(jié)合 GDP，在其活性形式中結(jié)合 GTP。鳥(niǎo)嘌呤酸交換因子（GEFs）如 SOS和 gp120 GAP（GTP酶激活蛋白）促進(jìn)核苷酸交換。gp120 GAP催化 Ras/GTP 中的 GTP 水解為 GDP，從而使 RAS 失活，而 SOS 促進(jìn) GDP 與 GTP 的交換并激活 RAS。
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RAS家族主要由KRAS、NRAS 和 HRAS 這三個(gè)成員組成，它們是人類(lèi)腫瘤中癌基因家族最常見(jiàn)的突變。其中，30%的腫瘤出現(xiàn)RAS突變。KRAS 是最主要的突變形式（85%），而NRAS和HRAS則較少見(jiàn)（分別為11%和4%）。
超過(guò)70%的RAS突變發(fā)生在RAS蛋白的G12、G13或Q61位置。10年前，KRAS 被認(rèn)為是“不可成藥靶點(diǎn)”。但是，Ostrem等人[PMID：24256730]通過(guò)共價(jià)靶向突變特異性游離半胱氨酸殘基的方法打開(kāi)了KRAS成藥之門(mén)。G12C 突變有利于維持 KRAS 的活化（GTP結(jié)合）狀態(tài)，增強(qiáng)了導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的信號(hào)。KRAS（G12C）存在于結(jié)腸癌和肺癌中，并成為一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)。
現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出兩種抑制劑，通過(guò)將 KRAS（G12C）鎖定在其非活性形式來(lái)阻斷 KRAS（G12C）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。這兩種KRAS（G12C）抑制劑的推動(dòng)了該領(lǐng)域的發(fā)展。由于RAS突變?cè)谌祟?lèi)腫瘤中的高頻率以及RAS相關(guān)腫瘤的有限的治療方案，對(duì)KRAS的研究依然非?；馃帷?/p>
藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)項(xiàng)目需要可靠的檢測(cè)方法來(lái)篩選和評(píng)估潛在抑制RAS異構(gòu)體的小分子化合物。BPS Bioscience主要提供兩種高通量篩選方法。一種是基于AlphaScreen?技術(shù)，另一種是利用BODIPY?-GDP熒光標(biāo)記的GDP/GTP交換檢測(cè)試劑盒。
02純化蛋白
右圖：使用不同濃度的p120GAP和2μM GTP，對(duì)KRAS-WT（50ng）和KRAS-G12C（100ng）的GTP酶活性進(jìn)行測(cè)試。
03?KRAS Nucleotide Exchange Assay Kit
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KRAS核苷酸交換檢測(cè)試劑盒是一種均相檢測(cè)方法，其利用熒光標(biāo)記的BODIPY?-GDP監(jiān)測(cè)核苷酸交換來(lái)篩選和評(píng)估KRAS抑制劑。加入過(guò)量的EDTA和GTP推動(dòng)反應(yīng)向活化的GTP-KRAS形式轉(zhuǎn)化。KRAS抑制劑通過(guò)將GDP-KRAS鎖定在其非活性、結(jié)合GDP的構(gòu)象中，阻斷了核苷酸交換。
該檢測(cè)方法針對(duì)兩種不同的優(yōu)化方案，以提供更大的靈活性。一種是在固定的GTP濃度下逐漸滴定抑制劑，另一種是在固定的抑制劑濃度下逐漸滴定GTP。
BODIPY?FL-GDP是一種混合異構(gòu)體，熒光染料通過(guò)連接基團(tuán)與核糖環(huán)的2'或3'位置連接而成。它是一種綠色熒光染料，具有類(lèi)似于熒光素或Alexa Fluor? 488的激發(fā)和發(fā)射特性，具有高消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率，并對(duì)pH變化相對(duì)不敏感。該染料的激發(fā)態(tài)壽命為5納秒或更長(zhǎng)。
04?KRAS(G12C) Coupled Nucleotide Exchange Assay Kit
原理：均相AlphaLISA?檢測(cè)
KRAS(G12C)耦聯(lián)核苷酸交換檢測(cè)（BPS Bioscience #78004）使用純化的帶有GST標(biāo)簽的RBD-RAF和帶有His標(biāo)簽的KRAS(G12C)在AlphaLISA?方法中監(jiān)測(cè)KRAS(G12C)與RBD-RAF的結(jié)合。谷胱甘肽受體珠和鎳螯合供體珠通過(guò)與GST標(biāo)記的RBD-RAF和His標(biāo)記的KRAS(G12C)結(jié)合，使其能夠在激光激發(fā)后發(fā)生能量傳遞。因此，當(dāng)KRAS(G12C)與RAF1形成復(fù)合物時(shí)，供體珠將熒光激發(fā)能量傳遞給受體珠。如果沒(méi)有形成復(fù)合物，則不會(huì)發(fā)生能量傳遞。
方 法
? 將非活性的GDP-KRAS(G12C)預(yù)先與待測(cè)的抑制劑在檢測(cè)緩沖液中孵育。
? 加入純化的SOS1和過(guò)量的GTP，并孵育反應(yīng)30分鐘。
? 加入純化的RAF1的RBD結(jié)構(gòu)域，孵育反應(yīng)30分鐘。
? 加入谷胱甘肽受體珠（PerkinElmer #AL109C）和鎳螯合供體珠（PerkinElmer #AS101D），孵育反應(yīng)30分鐘。
? 使用兼容的Alpha?酶標(biāo)儀讀板。
中部：GDP-loaded KRAS(G12C)從2μM逐漸稀釋至0μM，在SOS1(5μM)存在下使用該方法測(cè)量其與RBD-RAF1的結(jié)合。
底部：通過(guò)4-20% SDS-PAGE電泳后使用Coomassie染色來(lái)評(píng)估蛋白的純度。
結(jié)? 果
? 野生型KRAS的背景交換速率不為零（即在沒(méi)有SOS存在的情況下），因此該試劑盒不適合篩選KRAS/SOS相互作用抑制劑。
? 相反，使用AMG510等突變型KRAS(G12C)的共價(jià)抑制劑獲得了優(yōu)秀的結(jié)果。
05?相關(guān)產(chǎn)品
? 激酶測(cè)定試劑盒：EGF受體（野生型或突變型）、VEGF受體、FGF受體（野生型或突變型）。
? SHP-2測(cè)定試劑盒（#79330和#79317）。
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編譯自：
1. https://bpsbioscience.com/pub/media/poster_pdf/k/r/kras_poster_220906.pdf
2.?https://bpsbioscience.com/screening-profiling-services/kras?protein_family=kras
BPS Bioscience Inc.是一家科學(xué)家創(chuàng)建的科學(xué)家管理的生物技術(shù)公司。公司的科學(xué)家一直專(zhuān)注于活性重組酶和酶復(fù)合物的設(shè)計(jì)、表達(dá)、純化。此外，BPS還提供優(yōu)質(zhì)的重組細(xì)胞系和多種檢測(cè)試劑盒。BPS供應(yīng)超過(guò)4000種產(chǎn)品，同時(shí)提供多樣性的檢測(cè)服務(wù)和產(chǎn)品定制化服務(wù)。
