非特異性擴(kuò)增的問題

?PCR 可能而且經(jīng)常會(huì)遇到非特異性擴(kuò)增等問題。 錯(cuò)誤引物，其中引物結(jié)合 DNA 模板中的非特異性序列，導(dǎo)致 DNA 聚合酶擴(kuò)增錯(cuò)誤的模板 DNA 序列，是 PCR 后凝膠上非特異性條帶的原因之一。

如何消除 PCR 中的非特異性擴(kuò)增

仔細(xì)設(shè)計(jì) PCR 引物有助于減少脫靶結(jié)合的變化，盡管所需目標(biāo) DNA 的序列確實(shí)限制了選擇。 通過測(cè)試各種退火溫度和其他條件來優(yōu)化 PCR 條件是一種方法，另一種是使用Touchdown PCR。

什么是Touchdown PCR？

Touchdown PCR 是對(duì) PCR 的一種改進(jìn)，用于幫助減少非特異性退火和擴(kuò)增。 初始退火溫度設(shè)置為高于引物的最佳熔化溫度 (Tm)，然后在后續(xù)循環(huán)中逐漸降低，直到達(dá)到 Tm 或“著陸溫度”，就像飛機(jī)在跑道上著陸一樣（圖 1 ).

圖 1：Touchdown PCR 循環(huán)的表示以及退火溫度的變化。

在循環(huán)過程中將溫度逐漸降低到更允許的退火溫度有利于所需擴(kuò)增子的擴(kuò)增。

Touchdown PCR 的優(yōu)點(diǎn)

在所有類型的 PCR 中，確定最佳退火溫度至關(guān)重要。

通過在初始循環(huán)中使用高于計(jì)算的 Tm 的溫度，Touchdown PCR 有利于引物-模板互補(bǔ)性最高的擴(kuò)增子的積累。在隨后的循環(huán)中逐步過渡到較低的溫度，通過在反應(yīng)中使用所需的擴(kuò)增子來防止較低的產(chǎn)量，這些擴(kuò)增子現(xiàn)在勝過任何非特異性產(chǎn)物或引物二聚體。

Touchdown PCR 的五個(gè)關(guān)鍵技巧

1. 保持反應(yīng)冷靜

在熱循環(huán)開始之前保持所有反應(yīng)低溫對(duì)于避免非特異性啟動(dòng)至關(guān)重要，即使是使用TouchdownPCR。

2.使用熱啟動(dòng)設(shè)置

一旦您的反應(yīng)準(zhǔn)備就緒，最好使用熱啟動(dòng)設(shè)置，進(jìn)一步減少初始循環(huán)期間的非特異性相互作用。

3.考慮添加劑

如果使用Touchdown PCR 時(shí)仍然遇到問題，請(qǐng)考慮將其與添加劑結(jié)合使用。

4. 保持低周期數(shù)

太多循環(huán)會(huì)導(dǎo)致凝膠中出現(xiàn)非特異性條帶，表明非特異性擴(kuò)增。為限制這種情況，請(qǐng)將 PCR 擴(kuò)增循環(huán)的總數(shù)保持在 35 以下。

5. 添加一個(gè)額外的變性循環(huán)

在 96°C 或 97°C 下額外 1 分鐘的變性循環(huán)對(duì)于困難的模板可能非常有用。

簡(jiǎn)而言之，降溫 PCR 是一種通過從高退火溫度開始并在 PCR 循環(huán)中緩慢降低退火溫度直至達(dá)到所需退火溫度來限制非特異性擴(kuò)增的技術(shù)?？梢允褂肨D PCR 來克服非特異性擴(kuò)增和引物二聚體形成的問題。