2022年11月2日，華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院、嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室河源分中心王瑞龍研究員團隊的博士后Yousif Abdelrahman Yousif Abdellah在生物資源技術領域國際權威期刊《Bioresource Technology》（中科院1區(qū)Top期刊，IF:11.889）發(fā)表題為《Phytochemical and underlying mechanism of Mikania micrantha Kunth on antibiotic resistance genes, and pathogenic microbes during chicken manure composting》的論文，王瑞龍研究員為通訊作者。這是該團隊近來在國際環(huán)境科學與生態(tài)學領域知名期刊《Journal of Cleaner Production》（中科院2區(qū)Top期刊，IF:11.072）、《Environmental Pollution》（中科院2區(qū)Top期刊，IF:9.988）發(fā)表的第3篇關于外來入侵植物薇甘菊資源化利用的研究論文。相關研究得到了嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室河源分中心（DT20220002, DT20220015）、國家自然科學基金（31971554）、廣東省基礎與應用基礎研究基金自然科學基金（2019A1515012206）項目等的資助。該研究主要探究了薇甘菊對雞糞堆肥過程中病原微生物和抗生素抗性基因（ARGs）的影響，證明在堆肥過程中添加薇甘菊可促進植物化學物質的合成，而合成的植物化學物質通過抑制核心病原微生物的生長來降低其毒力，同時環(huán)境中的ARGs豐度顯著降低，表明薇甘菊可作為堆肥過程中的添加劑來進一步控制ARGs和病原微生物在自然界的擴散。文章中宏基因組測序和生信分析由歐易生物完成。

文章標題：Phytochemical and underlying mechanism of Mikania micrantha Kunth on antibiotic resistance genes, and pathogenic microbes during chicken manure composting

發(fā)表期刊：Bioresource Technology

影響因子：11.889

涉及的歐易生物服務產品：宏基因組測序

研究背景

雞糞（CM）是農業(yè)生產利用的重要資源，但由于雞糞中含有大量的病原微生物，密集的養(yǎng)殖條件中又使用大量抗生素，這些抗生素可通過糞便排出，導致大量病原微生物和抗生素在自然界中循環(huán)，而病原體、毒力因子基因（VFGs）和抗生素抗性基因（ARGs）的豐度是微生物污染風險評估的重要指標。薇甘菊（Mikania micrantha Kunth，MM）是一種有害的外來入侵植物，早期研究表明，薇甘菊不同部位中存在大量有抗菌作用和與抗生素有協(xié)同作用的植物化學物，目前將薇甘菊應用于堆肥過程的研究目前還很少，對于薇甘菊相關植物化學物是否可以降低ARGs、VFGs和病原微生物的研究也缺乏了解。

本研究旨在通過宏基因組分析，探究薇甘菊對雞糞堆肥過程中病原微生物和ARGs豐度的影響，以期更全面了解薇甘菊這種入侵物種作為添加劑在堆肥過程中的作用，從而間接改善生態(tài)環(huán)境。

研究結果

1. 薇甘菊在堆肥過程中對KEGG通路中分子功能的影響

進行宏基因組測序后，通過分析KEGG通路和碳水化合物酶檢出的相關基因豐度來探索在堆肥過程中薇甘菊所響應的分子功能變化，結果顯示，在添加薇甘菊進行堆肥后的第1天、第3天和第32天，KEGG L1水平富集的通路主要集中在代謝途徑上，并且在第32天代謝通路基因水平達到最高（圖1A）。在KEGG L2水平上，碳水化合物代謝相關基因水平隨著堆肥過程逐漸降低，T1樣本變化最為顯著（圖1B），說明添加劑在堆肥過程中促進了微生物活性，碳水化合物不斷消耗，代謝水平不斷升高。在KEGG L3水平上，與先前報道一致，不同抗生素在CK組樣本豐度更高，而萜類化合物則在T組樣本中豐度更高（圖1C），這些相關途徑主要通過形成植物化學物質作為抗菌素，從而阻斷病原體的生長和分布。此外，在堆肥過程中添加薇甘菊也能增強與植物化學形成相關的其他途徑，如萜類主鏈生物合成、泛醌和其它萜類醌生物合成，這些植物化學物豐度的增加則可能會協(xié)同抑制或減少堆肥產物中存在的廣譜ARGs（圖3b）。

圖1 | 雞糞堆肥過程中主要KEGG代謝通路和相關途徑的相對豐度

2. 薇甘菊對整個堆肥過程中抗生素變化的影響

進一步通過宏基因組測序評估抗生素以及ARGs如何響應薇甘菊在堆肥過程中所產生的影響，在CK1、CK3、CK32、T1、T3和T32中分別檢測到32、32、32、30、29和28種抗生素，在不同堆肥時期T組均有不同種類抗生素顯著低于CK組（p<0.05)（圖2），表明薇甘菊相關的植物化學物質對堆肥后期抗生素的消除有顯著積極作用，同時在堆肥結束階段，T32中的抗生素豐度顯著降低，可能是由于堆肥過程中溫度升高加速抗生素的降解。

圖2 | 堆肥樣品中抗生素類型的相對豐度

3. 堆肥過程中薇甘菊對抗生素耐藥機制和ARGs響應的進化機制

繼續(xù)對堆肥過程中微生物群落的抗生素耐藥機制進行分析，結果表明抗生素外排、抗生素失活和抗生素靶點保護是堆肥過程中主要的抗生素耐藥機制，表現(xiàn)為T組這三個功能的豐度顯著低于CK組（圖3a），說明添加薇甘菊可以限制堆肥產品中抗生素耐藥性機制的變化，從而減少其對環(huán)境的威脅。

堆肥后ARGs豐度的變化如圖3b所示，除MGEs外，抗大環(huán)內酯、抗磺胺和抗四環(huán)素的抗性基因在堆肥過程中始終保持相對高豐度，以往研究表明，堆肥很難降低磺酰胺抗性基因的豐度，但與CK組相比，T組樣本中抗大環(huán)內酯、抗磺胺相關基因和抗四環(huán)素相關基因的豐度均有下降趨勢，并且隨著堆肥的進行下降趨勢更為顯著，表明堆肥過程中添加薇甘菊可有效減少和去除這些抗生素抗性基因，而由于堆肥溫度的升高和與薇甘菊相關的植物化學物質具有廣譜殺菌功能共同導致了ARGs及宿主微生物的減少。

圖3 | 堆肥樣品中抗生素耐藥性機制相關基因的相對豐度變化

4. 薇甘菊對堆肥過程中致病菌豐度的影響

研究表明堆肥中PHIs的增加也會促進病原體的致病性和ARGs豐度，本研究同樣考慮了PHIs的分布和豐度，在CK1、CK3、CK32、T1、T3和T32樣本中，鑒定出的作為最高優(yōu)勢PHI的病原菌總數(shù)分別為47、47、46、45、44和33種（圖4），與T堆肥相比，CK堆肥具有更高的病原體數(shù)量，隨著堆肥的進行，在T3樣本中的豐度也進一步低于T1和CK3樣本（P < 0.05），甚至在T32中，某些病原體未被檢測到，這可能是植物化學物質增加所致，同時相對較高的堆肥溫度可能會通過改變堆肥的物理化學特征，使各種病原體失活，并濃縮抗生素的生物利用度，而由于堆肥過程中薇甘菊相關植物化學物質豐度和功能的差異，致使病原體的多樣性也存在顯著差異。

圖4 | 不同階段堆肥樣品中優(yōu)勢PHIs的總相對豐度

5. 薇甘菊通過堆肥對微生物毒性變化的影響

進一步探究堆肥過程中添加薇甘菊對病原體及其毒力因子的影響，結果顯示在堆肥過程中，優(yōu)勢VFGs的豐度存在顯著差異，CK組VFGs的豐度最大，各個時期T組與分枝桿菌、假單胞菌和鏈球菌相關的VFGs的豐度均顯著下降（見原文表2），表明薇甘菊可顯著減低堆肥產品中的病原體及其毒力因子。

6.堆肥過程中與薇甘菊相關的植物化學物質、ARGs和PHIs之間的關系

通過分析不同堆肥時間PHIs、ARGs和植物化學物KEGG豐度之間的關系發(fā)現(xiàn)，在整個堆肥過程中，T組的PHIs和ARGs豐度始終低于CK組，而T組與植物化學物質相關的KEGG豐度顯著高于CK組（圖5），PHIs豐度的降低可能是在雞糞堆肥中去除和減少某些ARGs導致，而增加的類黃酮等植物化學物質則有可能是作為抗菌劑來影響病原微生物的生長、功能或活力，或者通過靶向微生物的毒力因子來抑制抗生素耐藥性，表明與薇甘菊相關的植物化學物質通過堆肥改變了PHIs和ARGs的豐度和分布，解釋了薇甘菊抑制病原體生長的潛力，同時也改善了堆肥的質量和安全性。

圖5 | 堆肥過程中與植物化學物質相關的KEGG功能、ARGs和病原菌相對豐度之間的關系

7.堆肥過程中理化因素、ARGs和PHIs之間的關系

據(jù)報道，理化因素、微生物群落及其相互作用可能會顯著影響ARGs的分布和豐度，因此，作者繼續(xù)探究影響堆肥過程ARGs水平的其它理化因素，發(fā)現(xiàn)在堆肥過程中物理化學因素對ARGs和PHIs的影響顯著不同（圖6a），CK組堆肥溫度(T)、pH、含水量（MC）和TOC之間呈顯著的正相關關系（P < 0.05）；同時，pH與MC、TOC、部分ARGs和PHIs：1385（小麥鐮刀菌）呈顯著正相關（P < 0.05），而TOC與T、pH、MC和部分ARGs呈顯著正相關，這些結果表明，提高TOC比例可以通過增加宿主微生物的活性從而增加ARGs的豐度 （P < 0.05）。

溫度是堆肥過程中微生物群落分布變化的關鍵決定因素，T組的相關性結果顯示（圖6b），堆肥溫度(T)與病原微生物及部分ARGs呈顯著負相關，表明堆肥過程中的高溫可以有效地破壞堆肥產物中的病原微生物和ARGs，并且由于耐熱病原菌持續(xù)存在，導致溫度與部分病原菌和ARGs呈顯著正相關。同樣，pH、MC和TOC與不同ARGs和病原微生物也存在顯著正相關或顯著負相關情況，說明在堆肥過程中添加薇甘菊可通過改變微生物生長環(huán)境來影響ARGs的豐度及分布。這些結果進一步表明，薇甘菊可有效地重塑理化因素對PHIs和ARGs下降的影響，從而降低病原微生物及抗生素抗性基因等有害物的傳播與擴散，提高了堆肥產品的安全性。

圖6 | 基于理化因素、ARGs和PHIs之間的皮爾森積差相關性的多變量分析（MVA）

研究總結

本研究通過在雞糞堆肥過程中添加薇甘菊（MM）再進行宏基因組測序，通過分析植物化學物質相關的KEGG功能、ARGs和PHIs的豐度變化及相互之間的相關性，表明堆肥中ARGs豐度下降與薇甘菊含有的植物化學物質豐度的變化和堆肥過程中的理化因素有關，添加薇甘菊可促進堆肥過程中二苯乙烯類、二芳基庚烷類和泛酚類化合物的合成，這些合成的植物化學物質可通過抑制核心病原微生物的生長來降低其毒力，從而顯著降低ARGs的豐度。這些發(fā)現(xiàn)為證明薇甘菊作為添加劑可有效控制堆肥產品中ARGs和PHIs的擴散提供了有力證據(jù)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.128241

DOI:10.1016/j.biortech.2022.128241