文章標(biāo)題：N6-methyladenosine (m6A) in 18S rRNA?promotes fatty acid metabolism and oncogenic?transformation

發(fā)表期刊：Nature Metabolism

影響因子：19.865

作者單位：中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院

百趣生物提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝流分析

研究背景

能夠快速無限地生長和分裂是癌細(xì)胞最廣為人知的特征之一，癌細(xì)胞核糖體生物合成失調(diào)以及mRNA翻譯活性異常，均會促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，然而，癌癥中核糖體生物生成失調(diào)的分子機(jī)制仍不清楚。

核糖體生物發(fā)生是一個高度協(xié)調(diào)的過程，最近的研究表明，不同的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾在基因表達(dá)和癌癥進(jìn)展的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。rRNA占細(xì)胞總RNA的80%以上，并受到不同的修飾，但是對于rRNA修飾在調(diào)節(jié)癌癥中的rRNA加工和功能中的功能和機(jī)制知之甚少。關(guān)于mRNA中m6A的修飾已經(jīng)成為癌癥進(jìn)程的關(guān)鍵信號，而rRNA中m6A修飾的研究還有很多待揭示的問題。

為揭示METTL5介導(dǎo)的18S rRNA m6A修飾對決定細(xì)胞命運(yùn)和生長的作用，讓我們走入作者的研究故事。

研究結(jié)果

1.METTL5和TRMT112在各種癌癥中上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)

根據(jù)前人的報道在rRNA中存在兩個酶METTL5和TRMT112分別催化18SrRNA上1832位（m6A1832)和28SrRNA上4220位（m6A4220)的甲基化修飾。為了探明m6A修飾在癌癥進(jìn)程中的作用，作者首先對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)包括HCC在大多數(shù)TCGA癌癥類型中METTL5和TRMT112均顯著上調(diào)（圖1a-c），并且發(fā)現(xiàn)METTL5和TRMT112的高表達(dá)與肝癌患者的晚期病理分級、腫瘤分期、總體生存率均相關(guān)（圖1e-h）。為了進(jìn)一步確定上述現(xiàn)象，作者在HCC細(xì)胞系以及HCC組織樣本中做了進(jìn)一步確認(rèn)，正如預(yù)期的那樣，無論在細(xì)胞系還是組織樣本中，相較于對照組，METTL5和TRMT112的mRNA和蛋白水平均有不同程度的上調(diào)（圖1i-m）。同時m6A定量檢測也確認(rèn)了，在HCC細(xì)胞系和HCC患者樣本中m6A1832的修飾顯著增高（圖1n）。顯然METTL5和TRMT112介導(dǎo)的18S rRNA m6A修飾很可能在HCC的進(jìn)程中有重要的作用。

圖1. MettL5在各種癌癥中上調(diào)，并與低生存率相關(guān)

2.METTL5的過表達(dá)在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝癌進(jìn)展

為了深入研究METTL5的致癌功能，作者首先構(gòu)建了METTL5過表達(dá)肝癌細(xì)胞系（圖2a，b），顯然METTL5的過表達(dá)顯著的增加了HCC細(xì)胞中18S rRNA的m6A修飾（圖2c)。不出意外的，METTL5的過表達(dá)從生長、遷移、侵襲等各方面促進(jìn)了細(xì)胞系的活力（圖2d-k)。表明METTL5可以在體外促進(jìn)HCC的進(jìn)展。

回到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，METTL5的mRNA和蛋白質(zhì)在METTL5過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠模型中均顯著上調(diào)（圖2l-n）。腫瘤形態(tài)檢測與免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)同樣從表型角度表明METTL5過表達(dá)的小鼠腫瘤有更高的增殖活性，綜上所述，METTL5在體內(nèi)體外均會促進(jìn)HCC腫瘤的發(fā)生。

圖2. MettL5的過表達(dá)在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝癌的發(fā)生

3.METTL5介導(dǎo)的18S rRNA m6A修飾調(diào)節(jié)80S核糖體組裝和全局mRNA翻譯

為了全面分析METTL5在HCC中的功能，作者同樣的對HCC細(xì)胞中的METTL5進(jìn)行了敲低處理（圖3a）。在體外試驗(yàn)中，METTL5敲低的處理使得HCC細(xì)胞的生長能力和集落形成能力均有所降低（圖3b-d），除了增殖表型之外，METTL5的缺失對HCC的凋亡以及細(xì)胞周期均產(chǎn)生了不良的影響（圖3e-l），結(jié)合上文的過表達(dá)數(shù)據(jù)，表明METTL5確實(shí)對HCC細(xì)胞起到了促進(jìn)的作用。

作者進(jìn)一步探究METTL5的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在METTL5缺失的細(xì)胞中，18S rRNA的m6A修飾顯著減少（圖3m)，同時為了確定METTL5對18S rRNA的m6A的影響并非是通過影響18S rRNA表達(dá)量導(dǎo)致的，作者對18S rRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測（3圖o）。18S rRNA是核糖體的主要成分，作者進(jìn)一步研究METTL5對核糖體功能的影響機(jī)制，多聚體分析表明METTL5的敲減會使80S核糖體組裝受損（圖3q）。

圖3. MettL5基因敲除體外抑制肝癌的發(fā)生

4.METTL5調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的脂肪酸代謝

通過核糖體測序分析發(fā)現(xiàn)。受METTL5缺失影響的mRNA主要富集于非酒精性脂肪肝、脂肪酸生物合成等途徑，表明METTL5對HCC進(jìn)展的影響很可能與脂肪酸代謝重組相關(guān)（圖4a-c）。脂質(zhì)組學(xué)分析表明受METTL5敲除影響顯著降低的脂質(zhì)包括游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇（圖4d-f)。為了確認(rèn)這些受影響的脂質(zhì)的來源信息，作者做了[U-13C]葡萄糖的代謝流分析，發(fā)現(xiàn)許多長鏈脂肪酸及其下游產(chǎn)物均被U-13C標(biāo)記，表明這些脂肪酸來源于葡萄糖的生物合成，而隨著METTL5的敲除，這些碳代謝產(chǎn)物的U-13C標(biāo)記率顯著降低了，顯然METTL5影響了肝癌細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的重編程（圖4h）。

作者進(jìn)一步對長鏈脂肪酸進(jìn)行LC-MS分析表明，大多數(shù)長鏈脂肪酸特別是多不飽和脂肪酸隨著METTL5敲除顯著降低，對代謝物進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，這些顯著減少的多不飽和脂肪酸主要與β氧化途徑相關(guān)（圖4i-k），說明METTL5的缺失可能會損害細(xì)胞的β氧化。

圖4. MettL5敲除損害脂肪酸β-氧化

5.ACSL4介導(dǎo)MettL5在脂肪酸代謝和肝癌進(jìn)展中的功能

為了深入探究MettL5潛在的分子機(jī)制，作者分析了靶mRNA的特征，在富含脂肪酸代謝途徑的mRNA中，?；o酶A合成酶長鏈家族（ACSL）成員，包括ACSL1、ACSL3、ACSL4和ACSL5，在缺乏METTL5的細(xì)胞中顯示翻譯效率降低，同樣的METTL5缺乏的細(xì)胞中ACSL家族蛋白的表達(dá)水平也同步降低了（圖5f）。

ACSL家族能夠?qū)㈤L鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化脂肪?；o酶a酯，在癌癥的長鏈脂肪代謝中起到至關(guān)重要的作用，為了分析ACSL在METTL5對HCC調(diào)控中的作用，作者在METTL5敲除的細(xì)胞中過表達(dá)的了ACSL4進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。通過強(qiáng)制過表達(dá)ACSL4增加了細(xì)胞中的脂質(zhì)水平（圖5g-j）。同時細(xì)胞的增殖、集落形成、侵襲等能力均受ACSL4 表達(dá)而得到增強(qiáng)，（圖5k-q)，ACSL4 的強(qiáng)制表達(dá)同樣的減少了HCC細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)展（圖5r-u)。上述實(shí)驗(yàn)說明，ACSL4的過表達(dá)可以在一定程度上挽救因MettL5缺失而受到的影響的癌癥進(jìn)展。為了研究結(jié)論的完整性，作者通過在MettL5過表達(dá)體系中敲除ACSL4，以及添加β氧化阻斷劑的方式，證實(shí)了MettL5在肝癌中的致癌作用需要依賴ACSL4對脂肪酸β-氧化的調(diào)節(jié)作用。最后作者在小鼠體內(nèi)同樣的驗(yàn)證了上述現(xiàn)象。

圖5. ACSL4介導(dǎo)MettL5在脂肪酸代謝和肝癌進(jìn)展中的功能

研究小結(jié)

總的來說，本研究提供了強(qiáng)有力的體外和體內(nèi)證據(jù)，支持METTL5介導(dǎo)的18S rRNA m6A修飾在肝癌中的致癌作用。此外，作者還進(jìn)一步證明了rRNA表觀遺傳修飾、mRNA翻譯和脂肪酸代謝之間的交聯(lián)，為在轉(zhuǎn)化水平上開發(fā)肝癌治療的靶向治療提供了有力的證據(jù)。

科研延伸

BIOTREE非靶代謝流解決方案：無偏向性的檢測所有帶同位素標(biāo)記的代謝物，廣泛篩選同位素標(biāo)記的代謝物參與的代謝途徑或基因敲除前、后代謝速率變化。

文/阿趣代謝組學(xué)