血清總膽固醇的測定

【 實驗原理】

膽固醇（cholesterol）是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，它不僅參與血漿蛋白的組成，而且也是細(xì)胞 的必要結(jié)構(gòu)成分，在神經(jīng)組織和腎上腺中含量特別豐富，在肝、腎和表皮組織含量也很多。膽固醇是生物膜和神經(jīng)髓鞘的重要組成部分，是維持生物膜的正常透過能力不可缺少的。

膽固醇還可以轉(zhuǎn)化成膽汁酸、固醇類激素和維生素D3等。膽固醇主要隨膽汁從糞便排出體外。血液中的膽固醇僅有不到20%是從食物中攝取的，其余均由機體自身合成，肝、腸、腎、骨髓及內(nèi)分泌腺等均是合成場所。

由于血液與組織內(nèi)的膽固醇經(jīng)常不斷地交換，因此血清膽固醇水平基本能夠反應(yīng)膽固醇的攝取、合成及轉(zhuǎn)送情況。膽固醇與動脈粥樣硬化等有一定聯(lián)系，據(jù)國外報道體內(nèi)膽固醇長期偏低，是誘發(fā)癌癥的因素之一。因此，膽固醇的測定是臨床最普遍檢測項目之一。膽固醇在體內(nèi)以游離膽固醇（free cholesterol,FC）及膽固醇酯（cholesterol ester，CE）兩種形式存在，統(tǒng)稱總膽固醇。

總膽固醇的測定方法目前已超過200種，可分為化學(xué)試劑比色法、酶分析法、熒光法、氣相和高效液相色譜 法等五大類。由于氣相和高效液相色譜法條件高，臨床實驗室最常用的是化學(xué)試劑法和酶法。

化學(xué)試劑法一般包括抽提、皂化、純化、顯色比色四個階段。

化學(xué)法測定總膽固醇的比色原理主要分三類：

①與醋酐-硫酸試劑產(chǎn)生藍綠色。膽固醇酯和膽固醇在與醋酐-硫酸反應(yīng)時呈色深淺不同，因此用這種方法測定結(jié)果偏高。

②與高鐵-硫酸試劑產(chǎn)生紫紅色。高鐵-硫酸比色法靈敏度高，顯色穩(wěn)定，測定精密度好，是臨床檢驗?zāi)懝檀纪扑]方法。但干擾因素多。

③膽固醇與鄰苯二甲醛-硫酸試劑產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色。鄰苯二甲醛-硫酸比色法不需要對膽固醇進行抽提而直接進行測定。

酶法是目前常規(guī)應(yīng)用方法，其優(yōu)點是快速準(zhǔn)確、專一性強、樣本用量少、不需抽提，便于自動化分析 和批量測定，是中華醫(yī)學(xué)會檢驗學(xué)會推薦的膽固醇測定的常規(guī)方法。

高鐵-硫酸顯色法測定血清總膽固醇是用異丙醇為溶劑提取血清膽固醇，向異丙醇膽固醇抽提液中加入高鐵-硫酸顯色劑，膽固醇與顯色劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的紫紅色化合物，顏色深淺與膽固醇濃度成正比，可進行比色測定。

【器材和試劑】

1.器材 帶塞試管、微量移液器、721分光光度計 、快速混勻器、離心機、恒溫水浴箱。

2.試劑

（1）異丙醇（AR）

（2）三氯化鐵儲：稱取三氯化鐵（FeCl3﹒6H2O AR）0.1g/>，溶于100ml冰醋酸中。

（3）顯色劑：三氯化鐵儲存液與濃硫酸（AR）按1:1體積混合。

（4）5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲存液:精確稱取重結(jié)晶膽固醇（MW 386.66）200mg，用異丙醇溶解并稀釋至100ml，置冰箱保存。

（5）膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲存液4ml，移入100ml容量瓶中，加異丙醇至刻度線。

【 操作步驟】

1.取血清0.1ml，置于帶塞試管中，向管底吹入異丙醇2.4ml，沖散血清，使蛋白質(zhì) 沉淀，加塞混勻后置于60℃/>水浴1～2min。然后，于快速混勻器上混合15s。離心（3000r/min）5min，取抽提液待用。

2.取干燥試管3支，分別標(biāo)記空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測試管，按下表加入試劑。

試管號

空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

測試管

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液（ml）

—

1

—

抽提液（ml）

—

—

1

異丙醇（ml）

1

—

—

60℃/>水浴保溫1min

顯色液（ml）

3

3

3

60℃/>水浴保溫15min

冷卻后，選用波長540nm以空白管調(diào)零進行比色。讀取并記下吸光度?！居嬎恪?/p>

正常值：3.10～5.70mmol/L

【附注】

抽提液與顯色劑混合時產(chǎn)生熱量，發(fā)熱程度與顯色深淺有關(guān)，故操作時應(yīng)注意：

１.同一批標(biāo)本測定時需要同樣口徑及厚度的試管。為了便于快速混合，試管口徑最好大些。

２.沿管壁加入顯色劑，須與異丙醇抽提液分為兩層，然后迅速混合。不可邊加邊搖，否則顯色不完全。

3. 顯色劑必須加一管混合一管，不可加完后一起混合，混合手法也須一致。

【臨床意義】

　　成人膽固醇的正常值為：1100～2300mg/L（2.82～5.95mmol/L）總膽固醇增高，常見于以下疾病：

１.甲狀腺功能減退、動脈硬化、冠狀動脈粥樣硬化心臟病及高脂血癥等。

２.糖尿?。禾貏e是并發(fā)糖尿病昏迷時，幾乎都有總膽固醇升高。

３.慢性腎炎腎病期、腎病綜合癥、類脂性腎病等。

４.膽總管阻塞時，總膽固醇增高且伴有黃疸，但膽固醇與總膽固醇的比值仍正常。

５.長期高脂飲食、精神緊張或女性妊娠期，總膽固醇也可升高。

６.家族性高總膽固醇血癥（低密度脂蛋白受體缺乏），家族性載脂蛋白β缺乏癥、混合性高脂蛋白血癥。

總膽固醇降低見于以下疾?。?/p>

１.甲狀腺功能亢進、營養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病。

２.家族性無β或低β脂蛋白血癥。