做分子克隆的小伙伴想必都有這一經(jīng)歷：PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化，仔細檢查每一個步驟，可最終篩選陽性克隆時結(jié)果依然不盡人意，也想不出究竟哪一步出了問題，導致實驗十天半個月完全沒有進展，而無縫克隆，一步法構(gòu)建同源重組載體或許可以解決這一實驗難題。

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圖1 分子克隆示意圖

（a）傳統(tǒng)克?。╞）無縫克隆

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無縫克隆（Seamless Cloning/In-Fusion Cloning），與傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物克隆的差異在于載體末端和引物末端應具有15-20個同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補配對成環(huán)，無需酶連即可直接用于轉(zhuǎn)化宿主菌，進入宿主菌中的線性質(zhì)粒（環(huán)狀）依靠自身酶將缺口修復?；谶@個原理，漢恒生物開發(fā)出了HB-infusionTM 無縫克隆試劑盒。

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圖2 HB-infusionTM 無縫克隆試劑原理示意圖

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無縫克隆的優(yōu)勢

1.?相比傳統(tǒng)克隆，操作簡單，只需要一次反應即可完成定向克隆。

2.?對酶切位點無要求，可以把目的片段插入到載體的任意位點。

3.?連接片段之間不會引入其他序列。

4.?可以同時克隆多個片段。

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無縫克隆操作步驟

1.?制備線性化載體

（1）質(zhì)粒酶切法：在目標載體質(zhì)粒上選取合適的位點進行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進行割膠純化

（2）質(zhì)粒PCR法：在插入位點兩側(cè)設(shè)計一對方向相反的引物對載體進行擴增，通過跑膠回收獲取線性化載體片段

2.?目的插入片段制備

設(shè)計引物進行目的片段PCR 擴增，引物設(shè)計要保證目的片段兩端有15~25 bp 序列與線性化載體的兩端一致（重疊序列的Tm≥48℃，可以按A-T 堿基對=2℃，G-C 堿基對=4℃大致估算）便于拼接反應的進行。

PCR 引物包括5’端與載體同源的15~25 bp 以及目的片段特異性序列20~25bp（見下圖3）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)跑膠純化待用。

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圖3 PCR上下游引物設(shè)計示例

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3.?配制無縫克隆反應體系

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上述反應體系置于50℃孵育20 min（2-3 個片段拼接）/60 min（4-6 個片段拼接）。反應完成之后若不能馬上進行后續(xù)操作可將反應樣品暫儲存于-20℃。

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4.?轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，次日挑取克隆進行PCR或酶切鑒定

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以上就是本次的全部內(nèi)容了，介紹了無縫克隆的原理、優(yōu)勢和實驗操作，希望對做分子克隆的小伙伴有所幫助~

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