一文讀懂基因敲入細(xì)胞系原理
基因敲入細(xì)胞系
通過核轉(zhuǎn)染法將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點擴(kuò)增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。敲入熒光報告基因的也可以通過觀察熒光進(jìn)行初步篩選。
敲入方案
特定位點融合蛋白：
gRNA和Cas9復(fù)合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞以外源攜帶敲入片段的Donor作為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），將敲入片段重組到基因組靶位點。
敲除特定基因同時敲入外來基因片段：
服務(wù)流程及質(zhì)量控制
應(yīng)用案例
攜帶嵌合抗原受體（CARs）的T細(xì)胞可以介導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)，是治療B細(xì)胞惡性腫瘤的有效方法。通過CRISPR-Cas9技術(shù)，在T細(xì)胞中，利用Donor載體同源重組將具有CD19特異性的CAR片段替代TRAC基因，不僅可以在人外周血T細(xì)胞中獲得均勻的CAR表達(dá)，而且還可以增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。
CRISPR/Cas9靶向CAR基因整合入TRAC位點。
1928z是具有CD19特異性的CAR片段
TCR/CAR流式圖 Cas9，gRNA 和donor同時存在時，4天后能檢測到敲入蛋白CAR的表達(dá)。 Reference： Eyquem,
J., Mansilla-Soto, J.,Giavridis, T., van der Stegen, S. J., Hamieh, M.,
Cunanan, K. M., ...& Sadelain, M. (2017). Targeting a CAR tothe
TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour
rejection.?Nature,?543(7643), 113. 來源 | 源井生物 注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。 關(guān)注公眾號“源井生物”，了解更多基因編輯相關(guān)資訊。
