簡(jiǎn)介

光遺傳學(xué)是一門結(jié)合光學(xué)和遺傳學(xué)的跨學(xué)科技術(shù)，通過外源性表達(dá)光敏蛋白，用光控制或檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)。光遺傳學(xué)技術(shù)的開發(fā)得益于綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。如今種類豐富的熒光蛋白常用于生物標(biāo)記，使得細(xì)胞或有機(jī)體的活動(dòng)實(shí)現(xiàn)可視化，有助于更直觀地了解生物體的活動(dòng)規(guī)律。在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中，可以讓大腦神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)表達(dá)多種顏色不同的熒光蛋白，從而標(biāo)記不同的神經(jīng)細(xì)胞，即腦彩虹技術(shù)；但是如何利用熒光蛋白來顯示神經(jīng)活動(dòng)，且通過結(jié)合某種方法來精確、高效地控制和檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)，是神經(jīng)生物學(xué)家們研究的下一個(gè)熱點(diǎn)。后來科學(xué)家們受到視覺信號(hào)傳導(dǎo)的啟發(fā)，感光細(xì)胞能夠接收光信號(hào)并轉(zhuǎn)換電信號(hào)，最終傳遞到大腦，那么能否也類似地通過光刺激來控制神經(jīng)細(xì)胞呢？感光細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)換需要多種蛋白協(xié)同作用，考慮把這些基因一起外源性地表達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞中，顯然是不現(xiàn)實(shí)的。但是一個(gè)光敏蛋白即可實(shí)現(xiàn)這一功能，它屬于視蛋白的一種，能夠吸收不同波長(zhǎng)的激發(fā)光導(dǎo)致構(gòu)象改變，離子通道打開，引起細(xì)胞內(nèi)外電位變化。2002年的一項(xiàng)研究將感光蛋白—變視紫紅質(zhì)表達(dá)到體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元中，首次成功利用光控制神經(jīng)元興奮，打開了光遺傳學(xué)的大門[1]。雖然發(fā)展過程有坎坷和不被認(rèn)可，但在2010年被光遺傳學(xué)技術(shù)被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認(rèn)為是近十年來的突破之一，目前在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。

圖1 腦彩虹展示結(jié)果[2]

光遺傳學(xué)原理

??實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)的基本原理主要有三個(gè)方面：

????1、? 神經(jīng)元膜電位：神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)外存在電位差，神經(jīng)活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外電位產(chǎn)生變化。靜息神經(jīng)元的電位狀態(tài)為內(nèi)負(fù)外正，活躍神經(jīng)元的電位狀態(tài)即變?yōu)閮?nèi)正外負(fù)。

????2、? 光敏蛋白工作原理：光敏蛋白通過吸收不同波長(zhǎng)的激發(fā)光而打開離子通道，選擇性地允許陽離子或陰離子通過（如Na+、K+、Ca2+、H+、Cl-），使得膜電位發(fā)生變化，從而激活或抑制神經(jīng)活動(dòng)。

????3、? 光敏蛋白與熒光蛋白融合表達(dá)：熒光蛋白結(jié)構(gòu)可隨光敏蛋白結(jié)構(gòu)變化而變得緊密或松散，即可觀察到不同強(qiáng)度的熒光變化以顯示神經(jīng)活動(dòng)情況。

光敏蛋白的主要種類

?????? 光敏蛋白按功能分，有激活型和抑制型兩大類，其定位于細(xì)胞模上。不同蛋白的激活或抑制的機(jī)制不同，下面簡(jiǎn)單介紹下較為常用的光敏蛋白，更多的種類及特性參數(shù)參考表格1[3]。

圖2 光敏蛋白離子傳導(dǎo)途徑示意圖[3]

1、? 激活型光敏蛋白：

????（1）?ChR2（H134R）：視紫紅質(zhì)通道蛋白2（Channelrhodopsin-2，ChR2）的一種突變體，屬于光控陽離子通道，在藍(lán)光（最佳激活波長(zhǎng)450nm）的激發(fā)下打開陽離子通道，使胞外陽離子內(nèi)流。與ChR2相比，ChR2（H134R）的光敏感性較高，通道關(guān)閉速度較慢，因此增加了光電信號(hào)，但這也使得它的時(shí)間精度不如ChR2。

????（2）??ChETA：ChR2的另一突變體—ChR2（E123T），屬于陽離子通道蛋白。ChETA的通道動(dòng)力學(xué)比ChR2更快，降低了光電流幅度。然而，光敏感性大大降低，適用于高頻率光刺激，且吸收光譜紅移（最佳激活波長(zhǎng)490nm），也可與鈣離子成像實(shí)驗(yàn)同步。

????（3）??C1V1(t/t)：是來自衣藻的ChR1和團(tuán)藻的VChR1的嵌合突變體，包含兩個(gè)氨基酸突變—E122T、E162T，因此稱為C1V1(t/t)。屬于黃光（最佳激活波長(zhǎng)535nm）驅(qū)動(dòng)的陽離子通道蛋白。

2、? 抑制型光敏蛋白：

????（1）?eNpHR3.0：來源于從鹽堿古菌中分離出來的嗜鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白（Natronomonas halorhodopsin，NpHR），這是一種氯離子泵，屬于抑制型光敏蛋白。NpHR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)后定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)改造后添加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出元件和kir2.1鉀離子通道的上膜元件，使其能錨定在神經(jīng)元細(xì)胞膜上，并增強(qiáng)光電流，升級(jí)為eNpHR3.0。在黃光（最佳激活波長(zhǎng)590nm）的刺激下離子通道開放，引起Cl-內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超極化反應(yīng)，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)。eNpHR3.0是應(yīng)用最為廣泛的一種抑制型光敏蛋白。

????（2）Arch3.0：來自鹽紅菌產(chǎn)生的古視紫紅質(zhì)（archaerhodopsin，Arch）的升級(jí)版，這是一種質(zhì)子泵，能夠響應(yīng)黃光或綠光（最佳激活波長(zhǎng)566nm），介導(dǎo)胞內(nèi)H+外流。與其他抑制型光敏蛋白的等效版本相比，Arch具有更高的光電流和光敏感性，且能在軸突質(zhì)膜中大量表達(dá)。然而，通過添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出元件和神經(jīng)軸突靶向序列，對(duì)其功能進(jìn)一步增強(qiáng)，升級(jí)為Arch3.0，可適用于軸突信號(hào)輸出的快速抑制。這也使得Arch3.0能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)健、快速且額、可逆的突觸抑制。

表1. 光敏蛋白的種類及特性[3]

光遺傳學(xué)的一般實(shí)驗(yàn)方法：

????1、? 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的光敏蛋白，例如需要激活型還是抑制型、激活蛋白的最佳光波長(zhǎng)、通道相應(yīng)速率等等都需要考慮。

????2、? 選擇合適的表達(dá)載體，研究神經(jīng)活動(dòng)通常需要進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，因此腺相關(guān)病毒（AAV）較為常用（表2）。即將光敏蛋白的基因信息構(gòu)建到AAV，使用特異性血清型和啟動(dòng)子還可以實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞的感染和表達(dá)，例如使用Syn啟動(dòng)子在神經(jīng)元細(xì)胞中特異性表達(dá)等等。

????3、? 光控方式：在特定腦區(qū)局部植入光纖，實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性控制神經(jīng)元活動(dòng)；也可通過彌散光大范圍控制神經(jīng)元。

?4、檢驗(yàn)方法：電極記錄神經(jīng)元的電生理活動(dòng)變化；行為學(xué)評(píng)估神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)動(dòng)物行為的影響。

表2. 漢恒光遺傳AAV現(xiàn)貨

總言之，光遺傳學(xué)本質(zhì)上是跨學(xué)科的，需要可以針對(duì)特定細(xì)胞的基因調(diào)控工具、光傳輸技術(shù)以及光控方法和兼容性數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)。光遺傳學(xué)的發(fā)展開啟了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行毫秒級(jí)的光學(xué)控制，極大推動(dòng)了阿爾茲海默病、抑郁癥等疾病的研究，除此之外，也逐漸延申至肌肉、心臟和胚胎干細(xì)胞的研究中。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Zemelman BV, Lee GA, Ng M, Miesenb?ck G. Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron. 2002 Jan 3;33(1):15-22. doi: 10.1016/s0896-6273(01)00574-8.

[2] Weissman TA, Pan YA. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 2015 Feb;199(2):293-306. doi: 10.1534/genetics.114.172510.

[3] Yizhar O, Fenno LE, Davidson TJ, Mogri M, Deisseroth K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 2011 Jul 14;71(1):9-34. doi: 10.1016/j.neuron.2011.06.004.