免疫組化常見問(wèn)題及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)(一）

2022-12-13 17:22 作者:云柏奧-少峰 0人讀過(guò) | 我要投稿

最近從書上結(jié)合自己經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)整理了一些免疫組化的經(jīng)驗(yàn)，分享出來(lái)和大家交流學(xué)習(xí)，爭(zhēng)取共同進(jìn)步。

由于內(nèi)容太多，分兩次發(fā)，今天先發(fā)第一期。

固定

為什么要固定？

固定的目的是用人為的方法盡可能使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持生活狀態(tài)，防止組織細(xì)胞死后發(fā)生自溶和組織腐敗，固定還能增加組織塊硬度，使其更容易切片，使不同的結(jié)構(gòu)更容易染色。

常見組織及固定液選擇

常規(guī)的組織細(xì)胞固定都采用甲醛固定的方法，即10%中性甲醛液，目前它仍是組織細(xì)胞的最佳固定液，優(yōu)點(diǎn)是具有穿透力強(qiáng)、固定均勻、組織收縮小、硬度適當(dāng)，適用于一般器官組織的固定及保存。尤其對(duì)脂肪、神經(jīng)組織固定效果較好。
但它的缺點(diǎn)也是明顯的，首先它具很高的毒性，對(duì)病理技術(shù)人員有很大的危害性，再者經(jīng)甲醛固定的標(biāo)本不能滿足一些特殊染色的需要，對(duì)組織細(xì)胞中的很多成分保存不力。
淋巴結(jié)、胸腺、脾臟：新鮮的淋巴結(jié)樣本應(yīng)盡快進(jìn)行取材和固定。對(duì)于厚度為0.3cm的淋巴結(jié)組織塊，采用10%中性緩沖甲醛溶液固定的時(shí)間以12小時(shí)為佳；對(duì)于厚度為0.2cm的組織塊經(jīng)6小時(shí)固定也可獲較滿意的制片效果。
腎臟：可采用乙醇Bouin液固定；腎穿標(biāo)本可采用PB-FA（甲醛10mL+純乙醇70m l+濃度為0.05mol/L pH 7.2磷酸緩沖液20ml）固定液。
前列腺、睪丸：Bouin’s 液或用Hollande固定液（它 “軟化”組織可避免切片脆裂，苦味酸會(huì)溶解掉紅細(xì)胞，對(duì)骨髓活檢標(biāo)本還可以起到脫鈣作用）。
肝組織：可采用4%多聚甲醛固定液（時(shí)間以24小時(shí)效果最佳）。
腦組織：可采用4%多聚甲醛固定液（固定24小時(shí)以上）。
骨組織：可采用Muller液固定劑或FineFIX固定劑（骨髓可采用Zenker-甲醛固定液；胎兒指骨可采用Helly固定液）。
眼球：Bouin’s 液或Kolmer或Verhoeff（甲醛水溶液10ml，95%乙醇48ml，蒸餾水36ml，苦味酸1g，固定48小時(shí)）固定液。
固定糖原的固定劑可采用含高濃度苦味酸（Bouin液）、乙醇（無(wú)水乙醇）、甲醛溶液（甲醛100m l+自來(lái)水900ml+NaCl 9g，先將NaCl溶于水，再加入甲醛。
冰凍切片，冷丙酮固定10分鐘。

固定的一般要求

固定組織時(shí)，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的10～15倍以上。應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的5～10倍，最少也不應(yīng)少于五倍。
標(biāo)本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液對(duì)標(biāo)本的滲入。
根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時(shí)間應(yīng)有所不同，組織越大越厚，固定時(shí)間應(yīng)越長(zhǎng)，一般4～12小時(shí)或更長(zhǎng)。在溫箱內(nèi)將固定液稍加溫，可使固定作用加快而縮短固定時(shí)間。

脫水

常見組織脫水劑選擇

實(shí)質(zhì)器官組織如肝、腎、脾、腎上腺、甲狀腺、甲狀旁腺、淋巴結(jié)、腮腺、扁桃體、胸腺、胰腺等，這些器官組織都含細(xì)胞豐富，在脫水過(guò)程中易產(chǎn)生酥脆現(xiàn)象（細(xì)胞過(guò)度脫水收縮），所以不適于使用強(qiáng)脫水劑，如無(wú)水乙醇，丙酮等，而且在脫水過(guò)程中，切忌加熱和脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)?？梢允褂妹撍行缘脑噭?，如正丁醇、叔丁醇，這樣可以保證脫水后這些器官組織不變酥脆。
心臟、肺臟、子宮、前列腺、肌肉、舌、陰莖、睪丸、卵巢等器官，對(duì)脫水劑有較強(qiáng)的抵抗作用，脫水劑對(duì)其作用比較緩慢，不易滲透，所以比較適合用較強(qiáng)的脫水劑，如乙醇、丙酮，或乙醇丙酮的混合脫水劑。
胃、腸、膀胱、血管、輸卵管、輸尿管、闌尾、膽囊、食管等器官，對(duì)脫水劑的抵抗作用沒有那么強(qiáng)，但由于這些管狀器官是由多層不同組織構(gòu)成，故而脫水劑的穿透性太弱，效果也不會(huì)太好，這里建議以乙醇處理為當(dāng)，其他的脫水劑效果不甚理想。

組織脫水后出現(xiàn)發(fā)脆的原因是什么？

脫水過(guò)度容易造成組織發(fā)脆，造成組織發(fā)脆的原因還有加溫（溫度超過(guò)36℃）、脫水劑內(nèi)加有丙酮。脫水過(guò)度引起組織發(fā)脆可能是乙醇起始脫水濃度過(guò)高引起。

淋巴結(jié)的具體脫水方法是怎樣的？有些什么特殊的要求嗎？

淋巴結(jié)具有組織結(jié)構(gòu)致密、細(xì)胞豐富等組織學(xué)特點(diǎn)，其外圍有致密結(jié)締組織的被膜包繞。淋巴結(jié)的這些組織結(jié)構(gòu)特征就決定了其組織制片較其他組織制片相對(duì)難度大。最好不要使用太強(qiáng)的脫水劑，如丙酮等，最好使用較為溫和的脫水劑，而適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間是最好的辦法。
經(jīng)典方法：常溫80%乙醇（60分鐘）→95%乙醇Ⅰ （60分鐘）→95%乙醇Ⅱ（120分鐘）→叔丁醇Ⅰ （60分鐘）→叔丁醇Ⅱ （120分鐘）→叔丁醇Ⅲ （120分鐘）。

怎樣判斷是否是脫水出了問(wèn)題？

一種是脫水不足，組織在包埋蠟塊中呈現(xiàn)與石蠟硬度不一的現(xiàn)象，結(jié)果是雖能切出蠟帶，但蠟帶中組織不成片，這是因?yàn)槊撍粌?，使得透明劑與石蠟都無(wú)法浸入組織當(dāng)中，故而形成了沒有浸蠟的組織蠟塊；
另外一種是脫水過(guò)度，組織因?yàn)槊撍^(guò)度（脫水劑太強(qiáng)，脫水溫度過(guò)高、脫水時(shí)間太長(zhǎng)等）致使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化，即使透明劑和石蠟都順利浸透組織，但因組織本身已遭破壞，切出的片子也是很糟糕的，呈現(xiàn)組織細(xì)胞碎裂，收縮變形的現(xiàn)象。

石蠟包埋有些什么注意事項(xiàng)？

作為包埋組織使用的石蠟不僅由于氣候的不同需要加以選擇，而且與組織的硬度也有密切關(guān)系，過(guò)硬的組織最好用硬度較高的石蠟包埋，反之，軟組織則應(yīng)以硬度較低的石蠟包埋。其熔點(diǎn)一般要求在60℃左右。
包埋用石蠟加溫不可過(guò)高，以保持其不凝固為度，溫度過(guò)高容易將組織燙壞，使得組織變硬，變脆，并發(fā)生卷曲，收縮變形而不利于切片，甚至影響診斷。
包埋應(yīng)注意組織病變面放在下面，并盡可能使組織放平，在不損傷組織的情況下可用鑷子輕壓。
包埋應(yīng)注意組織病變面放在下面，并盡可能使組織放平，在不損傷組織的情況下可用鑷子輕壓。

包埋過(guò)程中組織的定向有什么嚴(yán)格的要求嗎？

組織的定向應(yīng)有利于減少切片時(shí)組織對(duì)刀片的阻力。大多數(shù)組織應(yīng)放平包埋，以確保組織周圍的包埋劑對(duì)組織有支撐作用。
需特殊定位的組織：1.管狀結(jié)構(gòu)：動(dòng)脈、靜脈、輸卵管、輸精管——以管腔的橫截面為包埋面。2.皮膚、腸管、膽囊和其他上皮活檢組織——應(yīng)垂直于表面取材，包埋方向以最后切到上皮面為準(zhǔn)，使上皮層的壓縮和變形降到最小。3.肌肉活檢組織——切片包括橫斷面和縱斷面。

切片

角度設(shè)置

注意刀的角度和刀刃角使刀刃長(zhǎng)時(shí)間保持在鋒利狀態(tài)。在切片的時(shí)候，將刀片安裝于刀架后，調(diào)整好刀架的角度（刀的角度）與切片刀的角度（刀刃角），一般刀的角度為20°～30°，刀刃角為5°～10°。一般硬的組織，刀刃角增大，不同組織的刀刃角也有所不同，選擇適宜組織的刀的角度和刀刃角能最大限度保護(hù)刀刃，使刀刃長(zhǎng)時(shí)間保持在鋒利狀態(tài)。

巧用毛筆

毛筆不接觸刀刃：保證切片時(shí)毛筆不接觸刀刃是保護(hù)切片刀又一個(gè)操作細(xì)節(jié)。
用毛筆清理切片刀架上的蠟條碎屑時(shí)，注意毛筆的方向始終是往上的，也就是從刀架的底部往刀刃方向刷動(dòng)。

刀片粗細(xì)分開

一方面，粗切和微細(xì)切片使用不同的刀片；
另一方面是同一刀片不同刀面進(jìn)行粗切與細(xì)切。刀片使用的時(shí)候，首先從最左邊的刀刃開始，這個(gè)位置的刀刃變鈍后，就只進(jìn)行粗刀，微細(xì)切片的位置選擇在相鄰的右側(cè)新刀刃上。

刀片保管

每一次切片結(jié)束后，宜把刀片卸下，放入切片刀盒子中。目的是減少刀片暴露在空氣中的時(shí)間過(guò)久刀刃氧化，容易變鈍。

搖輪

切片時(shí)搖輪的手法很重要，粗切時(shí)可以稍快，但左手進(jìn)刀量不要太大，以免啃掉大塊組織。細(xì)切時(shí)要慢搖，動(dòng)作要平穩(wěn)，那種咣當(dāng)咣當(dāng)急搖的現(xiàn)象不可取。
經(jīng)驗(yàn)決定切片的速度，但一般應(yīng)該用平穩(wěn)緩慢的速度切片。如果在切取平整光滑切面有困難時(shí)，在切片過(guò)程中用溫水暖一下組織表面或?qū)M織塊表面輕輕地呼一口氣可能有幫助。這樣做有舒展組織塊的作用，但切片會(huì)稍微厚一點(diǎn)。

蠟塊冰塊冷凍

細(xì)切時(shí)，蠟塊最好用冰塊冷凍一下，有人說(shuō)要有冷臺(tái)就不用冰塊，太麻煩，但冰塊的作用不光是冷凍，它還起到濕潤(rùn)，去除靜電的作用，對(duì)蠟帶的完好保存有益處。

展片

水溫要合適（42～45℃），不能太高，水溫高切片容易漂散，水溫過(guò)低，切片不易展開，在入水前加一道乙醇（30%），效果會(huì)更好。

切片厚度

一般我們把切片厚度定在4μm，但一些特殊的組織也要做調(diào)整，如脂肪組織就要厚一些，一般在5～6μm；淋巴結(jié)、甲狀腺等要薄一些，一般在3～4μm。
有人認(rèn)為：只要切片機(jī)刻度標(biāo)著幾個(gè)微米，切出來(lái)的片子就是幾個(gè)微米。其實(shí)不然，當(dāng)切片刀不鋒利，或切片時(shí)速度不勻，或切的較慢時(shí)，切的片子都會(huì)變厚，只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下，才能真正保證其厚度。

切片常見問(wèn)題與對(duì)策

1.組織發(fā)脆：一般是脫水、透明、浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)，在切片時(shí)，邊切邊用嘴向蠟片吹氣，可能會(huì)好些。
2.切片卷起，可能是刀不鋒利，或刀鋒在另一面，或刀角度過(guò)大，切片太厚等。
3.蠟片彎曲：可能是刀鋒不均，切片刀未磨直，切片刀與蠟塊不平行。透明、浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)。
4.厚薄不均：可能是刀、刀座及蠟塊未夾緊，組織太硬，或切片機(jī)主軸太向前，或切片機(jī)已磨損。
5.出現(xiàn)裂痕：可能是刀有缺口，石蠟內(nèi)有雜質(zhì)，組織內(nèi)有鈣化、骨片或有線結(jié)，也可能會(huì)有棉紙纖維等。
6.切片困難：切片不連片，切不下片，切片很厚，或者切片后蠟塊攪白，主要由于組織處理失敗，或切片刀出現(xiàn)問(wèn)題。
7.組織內(nèi)陷：組織脫水不佳，補(bǔ)救辦法：可先將蠟塊溶解，取出組織，放入加熱水浴的丙酮內(nèi)（80℃），30～60分鐘，再進(jìn)行透明浸蠟包埋切片，也許會(huì)好一點(diǎn)。