構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans），也被稱為構(gòu)巢曲霉（Emericella nidulans），是遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中重要的真菌系統(tǒng)之一。它一直是研究真核細(xì)胞生物學(xué)的重要研究對象，也是當(dāng)下科研界最看重的一方面，這些包括重組，DNA修復(fù)，突變，細(xì)胞周期控制，微管蛋白，染色質(zhì)，慢病毒包裝，核動(dòng)力學(xué)，致病性，代謝和實(shí)驗(yàn)進(jìn)化。?

真菌在降解生態(tài)系統(tǒng)中的生物量方面起著重要作用，因?yàn)樗鼈儠?huì)降解所有類型的有機(jī)物。因此，它們是與工業(yè)有關(guān)的酶有主要來源，例如淀粉酶，纖維素酶，脂肪酶，果膠酶和蛋白酶。完全測序的真菌基因組的數(shù)量正在迅速增加。由于大多數(shù)絲狀真菌的遺傳工具開發(fā)欠佳，因此目前很難使用基因工程來了解這些真菌的生物學(xué)特性并在工業(yè)中充分利用它們。因此，為了開發(fā)一種可用于遺傳操縱非模型絲狀真菌的通用方法，科學(xué)家們開發(fā)了一種適用于絲狀真菌的基于CRISPR-Cas9的系統(tǒng)。CRISPR技術(shù)通過提高可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的速度和復(fù)雜性，徹底改變了真菌基因工程。另外，該系統(tǒng)的效率通常允許將基因工程引入非模型物種。紫花苜蓿（Emericella nidulans）作為工業(yè)化學(xué)品和酶的來源已有很長的生產(chǎn)歷史，并且是用于研究遺傳調(diào)控，發(fā)育生物學(xué)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和次級代謝的發(fā)育模型系統(tǒng)。因此，基因敲除，基因敲入或點(diǎn)突變將成為研究構(gòu)巢曲霉的新方法。

CRISPR在構(gòu)巢曲霉中高效無標(biāo)記基因靶向中的應(yīng)用

特定Cas9/sgRNA介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）的存活取決于向NHEJ DNA修復(fù)途徑中添加非同源末端。我們利用這一觀察結(jié)果開發(fā)了TAPE工具，以評估構(gòu)巢曲霉原型間隔物的效率。而且，在NHEJ缺陷型菌株中，可以進(jìn)行有效的無標(biāo)記基因靶向。確實(shí)，該研究表明，甚至單鏈寡核苷酸也可以有效地用作構(gòu)巢曲霉和黑曲霉中特定Cas9/sgRNA誘導(dǎo)的DNA DSB的修復(fù)模板，表明這種修復(fù)類型可能廣泛分布于絲狀真菌傳播中。 重要的是，通過使用單鏈寡核苷酸進(jìn)行CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯，可以以接近100％的效率引入特異性點(diǎn)突變和基因缺失（基因敲除）。因此，可以在一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中非常有效地引入兩點(diǎn)突變和單基因插入。

Cpf1可以在Aspergilli中快速有效地執(zhí)行基因組編輯

CRISPR基因編輯的效率歸因于RNA引導(dǎo)的核酸酶形成的特定DNA雙鏈斷裂。到目前為止，在絲狀真菌中，只有Cas9被用作CRISPR核酸酶。由于用Cas9編輯的基因受到其5'-NGG-3'原間隔子相鄰基序（PAM）序列的限制，因此重要的是，引入依賴于其他PAM序列的RNA指導(dǎo)的核酸酶以靶向更大的基因組位點(diǎn)?；蚯贸竽c桿菌的Cpf1使用由5'-TTTN-3'組成的PAM序列，因此實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)是一個(gè)有吸引力的選擇。在這項(xiàng)研究中，針對構(gòu)巢曲霉優(yōu)化的Lb_cpf1密碼子可用于絲狀真菌中基于CRISPR的基因編輯。研究人員開發(fā)了一種基于載體的設(shè)置用于Cpf1介導(dǎo)的CRISPR實(shí)驗(yàn)，并表明它可以在構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的不同基因座上高效工作。具體而言，Cpf1可以催化寡核苷酸介導(dǎo)的基因組定向誘變和無標(biāo)記基因靶向。結(jié)果表明，Cpf1可以有效地用于曲霉中的基因編輯，從而擴(kuò)大了CRISPR技術(shù)可靶向的基因組DNA序列的范圍。

Nidulans中的高效CRISPR敲除

在構(gòu)巢曲霉中，可以通過轉(zhuǎn)化過程中的同源重組進(jìn)行基因靶向，但是正確的基因靶向頻率是可變的，通常較低。研究人員確定了人KU70基因的構(gòu)巢曲霉（nkuA），這對于雙鏈斷裂修復(fù)中DNA的非同源末端連接至關(guān)重要。 nkuA（nkuAΔ）的缺失大大降低了轉(zhuǎn)化DNA片段的非同源整合的頻率，從而顯著提高了基因靶向性。在構(gòu)巢曲霉中也已經(jīng)開發(fā)了替代的異源標(biāo)記，但是在構(gòu)巢曲霉基因組中的任何時(shí)候都沒有指導(dǎo)整合。 nkuAΔ和異源選擇標(biāo)記一起形成非常有效的靶向sy的基因。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

References:

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