Thyl 系膜增生性腎炎動(dòng)物模型【北京實(shí)驗(yàn)代做】

【造模機(jī)制】 Thy1 抗原是大鼠胸腺細(xì)胞分化抗原,利用大鼠胸腺細(xì)胞作為抗原免疫家兔制備的免抗大鼠的 Thyl 抗血清(ATS)可直接與系膜細(xì)胞表面抗原結(jié)合、固定補(bǔ)體形成膜攻擊復(fù)合體使細(xì)胞溶解,繼而引起殘存的系膜細(xì)胞增生,并經(jīng)幾次攻擊后,系膜細(xì)胞增生且能較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù),誘發(fā)成 Thy1 系膜增生性腎炎模型。

【造模方法】

1、動(dòng)物和免疫細(xì)胞大鼠胸腺細(xì)胞懸液制備:低齡 SD 大鼠1 只,麻醉后取胸腺,剪碎并擠出胸腺細(xì)胞,經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去混雜的組織,濾液為淋巴細(xì)胞懸液,離心,無(wú)菌 PBS懸浮,計(jì)數(shù)懸液中淋巴細(xì)胞數(shù),調(diào)細(xì)胞密度至 10"L。

2.免疫血清和效價(jià)測(cè)定雄性 NZW 兔,卡介苗預(yù)致敏,14 天后兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)腫大。注射抗原(胸腺細(xì)胞十弗氏完全佐劑),3 周后同樣途徑再次免疫,2 周后經(jīng)耳緣靜脈第 3次免疫,1 周測(cè)效價(jià),滿意后頸動(dòng)脈放血,收集血清,經(jīng) 56℃,30 分鐘滅活補(bǔ)體,大鼠肝粉吸附,備用。ATS組織效價(jià)測(cè)定:用正常低齡大鼠胸腺冷凍片,ATS稀釋度1：20～1；640,PAP法免疫組化測(cè)定效價(jià)。正常兔血清(1：40)對(duì)照。

3.大鼠 Thyi 腎炎模型的制作雄性 SD大鼠 150g左右,實(shí)驗(yàn)組(n=45),尾靜脈注射ATS,每周 1 次,連續(xù) 4 周。對(duì)照組(n=10)。分別于 1 天、3 天、5 天、7 天、2 周、3 周、4 周和5 周處死動(dòng)物,取腎臟做相應(yīng)檢查。普通 HE 染色,計(jì)數(shù) 20 個(gè)腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù),取均值。免疫組化 ABC 法作 PCNA(華美公司)、&平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA,Dako)染色。計(jì)數(shù) 20 個(gè)腎小球內(nèi) PCNA 陽(yáng)性數(shù),取均值;a-SMA 采用 Floege 半定量法,計(jì)數(shù) 20 個(gè)腎小球內(nèi)積分,取均值。

【模型特點(diǎn)】

1.連續(xù) 4 次注射兔抗大鼠 Thyl 抗血清(ATS),4 周即可成功地建立 Thyl 系膜增生性腎炎模型。

2.病變明顯,系膜基質(zhì)增多顯著,病變腎小球體積增大,第 1 天系膜溶解,腎小球數(shù)明顯減少,第 3 天細(xì)胞開(kāi)始增生,第 7 天顯著增加,第 3 周細(xì)胞數(shù)由正常 54.03±2.08 增加到100.50±9.85,并可維持到第 5 周。

3.應(yīng)用 PCNA、G-SMA 作為增殖指標(biāo)觀察系膜細(xì)胞的增生情況,結(jié)果顯示改進(jìn)型動(dòng)物模型在病變誘導(dǎo)的 28 天、35 天時(shí),表達(dá) PCNA,a-SMA 的陽(yáng)性細(xì)胞仍較多,較正常動(dòng)物組,細(xì)胞增生明顯(P<0.05)且病變持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

【應(yīng)用范圍】深入研究以系膜增生為主要特征的腎炎的發(fā)病機(jī)制,并探討其防治措施。目前該模型已應(yīng)用于中藥藥效學(xué)及臨床治療研究。

【注意事項(xiàng)】

1. ATS 必須連續(xù) 4 次注射單次注射 ATS 引起的腎炎,在病變的第14 天已很少測(cè)出PCNA 和 a-SMA 的陽(yáng)性細(xì)胞,第 21 天時(shí)已不表達(dá)。

2. ATS 單次注射后 3 天、5 天系膜增生明顯,但以后逐漸緩解,故 Thy1 腎炎是一個(gè)自限性的系膜增生腎炎。為了使該模型病變明顯且能較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在,應(yīng)在首次注射 ATS后,每周一次,連續(xù)注射 4 周。

【模型評(píng)估】腎小球系膜細(xì)胞增生以及系膜基質(zhì)增多是多種類型的腎炎常見(jiàn)而又突出的病理變化,往往也是腎小球硬化早期階段的表達(dá)。該模型腎炎病變明顯,系膜細(xì)胞增生顯著且持續(xù)存在,系膜細(xì)胞 α-SMA 持續(xù)陽(yáng)性,表明系膜細(xì)胞一直處于活化增殖階段,病變持續(xù)活動(dòng),更符合臨床上所見(jiàn)到的人類的系膜增生性腎炎。該模型在原模型基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良,增加弗氏完全佐劑增強(qiáng)免疫,縮短造模時(shí)間,癥狀典型,是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的系膜增殖性腎炎模型。

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