前言

前列腺炎是一種泌尿生殖系統(tǒng)疾病(CP/CPPS)，是最常見的前列腺炎類型，約占前列腺炎人群的90%-95%。CP/CPPS以盆腔長期慢性疼痛伴或不伴低尿路癥狀為特征，已成為全球公認(rèn)的男性健康威脅。近年來越來越多的證據(jù)表明免疫失衡在發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。因此，CP/CPPS也被認(rèn)為是一種器官特異性的自身免疫性疾病。T淋巴細(xì)胞，特別是CD4+T細(xì)胞，被發(fā)現(xiàn)是CP/CPPS發(fā)病機(jī)制的主要貢獻(xiàn)者，Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個子集，據(jù)報道，Th17細(xì)胞與多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

2022年7月，安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科梁朝朝教授課題組在《Frontiers in Immunology》（IF：8.796）期刊發(fā)表了題為“Gut Microflora Modulates Th17/Treg Cell Differentiation in Experimental Autoimmune Prostatitis via the Short-Chain Fatty Acid Propionate”的研究成果，本研究運(yùn)用糞便16s rRNA測序和非靶向/靶向代謝組學(xué)等研究方法分析了EAP小鼠腸道微生物組和代謝產(chǎn)物，以研究EAP中腸道微生物群和相關(guān)代謝物的豐度是否發(fā)生改變，從而發(fā)現(xiàn)腸道菌群通過其代謝物對EAP小鼠模型中免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的影響。

杜和喜、岳少宇、牛迪為第一作者，梁朝朝、張力、陳先國、李春為共同通訊作者，歐易/鹿明生物提供該項(xiàng)目糞便16s rRNA測序和非靶向/靶向代謝組學(xué)相關(guān)工作。

研究背景

腸道菌群系在調(diào)節(jié)宿主的免疫/炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。一般來說，腸道菌群的系統(tǒng)功能主要?dú)w因于微生物代謝組，特別是短鏈脂肪酸(SCFAs)，這是膳食纖維發(fā)酵最具特征的最終產(chǎn)物。一方面，這些細(xì)菌來源的SCFAs可以進(jìn)入循環(huán)，調(diào)節(jié)腸外器官中的免疫系統(tǒng)，包括Th17和Treg細(xì)胞。另一方面，SCFAs已被證明可以促進(jìn)腸道中的免疫細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)和遠(yuǎn)端組織。因此，SCFA代謝與免疫紊亂之間的關(guān)系已被證實(shí)和接受。目前尚不清楚腸道微生物驅(qū)動的SCFAs是否對前列腺炎有影響。

研究思路

實(shí)驗(yàn)方法

研究材料：小鼠

研究流程：

1.EAP的小鼠模型建立

2.組織病理學(xué)和免疫組化

3.流式細(xì)胞儀

4.CD4+T細(xì)胞的分離和體外分化

5.慢病毒感染

6.酶聯(lián)免疫吸附測定

7.DNA提取和16s rRNA測序

8.糞便非靶向/靶向代謝組學(xué)

9.SCFAs測量分析

10.丙酸SCFA治療分析

11.蛋白印跡分析

12.實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

13.糞便微生物群移植

研究結(jié)果

1.Th17和Treg細(xì)胞比例及EAP相對細(xì)胞因子水平顯著異常

在本研究中，作者首先通過兩次皮下免疫建立了EAP小鼠模型(圖1A)。EAP模型通過組織學(xué)檢查和盆腔疼痛測量結(jié)果進(jìn)行評估。如圖1B-D所示，與對照組相比，EAP組的前列腺炎癥和對觸覺異常痛的反應(yīng)頻率均明顯增加，說明小鼠EAP模型建立成功。接下來，作者分析了對照組和EAP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17和Treg細(xì)胞的百分比。最后，作者對兩組前列腺切片進(jìn)行IL-17A和FoxP3進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示，EAP小鼠前列腺組織中il-17a陽性染色細(xì)胞比例增加，foxp3陽性染色細(xì)胞比例降低(圖1M、N)。

圖1 | 評價EAP模型、Th17/Treg細(xì)胞比例及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子水平

2.EAP中糞便代謝組的改變

腸道菌群在免疫穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，通常通過其代謝物調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)。因此，作者運(yùn)用代謝組學(xué)分析來研究EAP小鼠的腸道代謝譜。通過對糞便進(jìn)行GC-MS非靶向代謝組學(xué)分析 ，發(fā)現(xiàn)對照組和EAP小鼠之間共有94種代謝物的豐度差異(圖2A，B)。我們進(jìn)一步對對照組和EAP組之間的差異表達(dá)通路進(jìn)行了KEGG通路富集分析(圖2C)。

圖2 | 對照組和EAP小鼠的代謝組學(xué)譜

3.EAP的腸道菌群與對照組有顯著差異

EAP小鼠的脂肪多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、觀察物種指數(shù)和PD_whole_tree均顯著低于對照組，表明腸道微生物群的a-多樣性發(fā)生了顯著改變(圖3A）。PCoA分析是生物多樣性的一個指標(biāo)，結(jié)果顯示對照組和EAP小鼠樣本之間存在明顯的分離，表明兩組之間的微生物群組成存在顯著差異(圖3B)。在門水平上，EAP小鼠的厚壁菌門的相對豐度較少，硝化螺旋體、芽胞菌和梭菌門。相反，作者在EAP組中檢測到擬桿菌門、藍(lán)藻菌門和白腹桿菌門的增加(圖3C）。在屬水平上，EAP中乳酸菌明顯增加，而其他9個菌群明顯減少(圖3D）。

圖3 | 對照組和EAP小鼠腸道微生物群的比較

4.EAP中丙酸顯著降低

通過靶向代謝組學(xué)測定六種最豐富的短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸和異丁酸）在糞便和血清中的濃度。發(fā)現(xiàn)對照組小鼠糞便中丙酸的濃度高于EAP組，其他SCFAs均無差異(圖4A）。對EAP小鼠血清中SCFA濃度的分析也顯示丙酸含量顯著下降(圖4B）。

圖4 | 對照組和EAP小鼠中SCFAs的絕對濃度

5.補(bǔ)充丙酸可改善EAP，恢復(fù)體內(nèi)Th17/Treg失衡

根據(jù)飲用水中是否加入丙酸，將EAP小鼠分為未處理組(EAP組)和丙酸處理組(EAP+PA組)(圖5A)。值得注意的是，補(bǔ)充外源性丙酸顯著降低了EAP小鼠的前列腺炎癥和盆腔疼痛(圖5B-D)。此外，丙酸處理抑制了EAP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞的分化(圖5E-H），但有利于Treg細(xì)胞的分化(圖5I，J）。此外，口服補(bǔ)充丙酸可降低了EAP小鼠血清中IL-17和GM-CSF的產(chǎn)生，而增加了TGF-b和IL-10的分泌(圖5K）。在前列腺組織中觀察到與IL-17、TGF-b和IL-10水平相似的結(jié)果(圖5L）。

圖5 | 丙酸可改善EAP，恢復(fù)體內(nèi)Th17/Treg失衡

6.丙酸在體外調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞的分化

作者通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估了丙酸對EAP的影響。用丙酸分離出在Th17/Treg分化條件下的CD4+幼稚T細(xì)胞(圖6A，D)。與預(yù)期的一樣，丙酸可以抑制更多的CD4+幼稚T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞(圖6B），而它也與促進(jìn)向Treg細(xì)胞的分化有關(guān)(圖6E）。

圖6| 丙酸在體外調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞的分化

7.丙酸通過調(diào)節(jié)GPR43-HDAC6軸來調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的分化

為了探討丙酸是否以GPR依賴的方式調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞的分化，作者檢測了GPR43的表達(dá)，這是在免疫和代謝中發(fā)揮重要作用的GPRs之一，以及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)HDAC6（31）。首先，在Th17和Treg細(xì)胞條件下，丙酸刺激下GPR43的表達(dá)增加，而使用LV-shGPR43則抑制了GPR43的表達(dá)(圖7A)。作者還觀察到，當(dāng)分離的CD4+T細(xì)胞用丙酸處理，并在Th17/Treg分化條件下孵育時，HDAC6的表達(dá)水平降低。然而，在LV-shGPR43感染后，它顯著增加(圖7B）。另外，抑制GPR43有助于Th17細(xì)胞分化的急劇增加(圖7C，D），而Treg細(xì)胞的分化明顯減少(圖7E，F(xiàn)）。前列腺組織的免疫組化檢測顯示，在LV-shGPR43處理的EAP小鼠中，GPR43陽性細(xì)胞減少，HDAC6的表達(dá)水平增加(圖7G，H)。

圖7 | 丙酸通過調(diào)節(jié)GPR43-HDAC6軸來調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的分化

8.EAP糞便移植可誘導(dǎo)受體Treg細(xì)胞頻率的降低

為了進(jìn)一步確定腸道微生物群的改變是否導(dǎo)致了EAP中Th17/Treg的失衡，作者運(yùn)用糞便移植實(shí)驗(yàn)，將對照組或EAP小鼠的糞便懸液灌胃到抗生素處理的偽無菌受體小鼠中(圖8A)。圖8B-E中，與對照組小鼠的糞便移植相比，EAP小鼠的糞便移植中Treg細(xì)胞的比例明顯降低(p0.05)。因此，將腸道微生物從EAP供體口服轉(zhuǎn)移到健康受體中，導(dǎo)致其Treg細(xì)胞頻率的降低。

圖8 | EAP小鼠糞便移植誘導(dǎo)受體小鼠Treg細(xì)胞頻率降低

研究討論

1.EAP中Th17/Treg處于不平衡狀態(tài)。

2.對照組和EAP小鼠的腸道微生物衍生代謝物存在顯著差異，為研究微生物衍生代謝物中脂肪酸在EAP中的作用提供了線索。

3.在EAP中，微生物源性的丙酸顯著降低。

4.丙酸有助于改善前列腺炎癥，恢復(fù)EAP誘導(dǎo)的Th17/Treg失衡。

5.丙酸有助于在體外調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，進(jìn)一步加強(qiáng)丙酸在EAP中的免疫調(diào)節(jié)作用

小鹿推薦

本研究為了揭示腸道菌群是否影響CP/CPPS，及其背后的潛在機(jī)制，通過皮下免疫建立了一個實(shí)驗(yàn)性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠模型，運(yùn)用糞便16srRNA測序和非靶向/靶向代謝組學(xué)，探索腸道菌群在免疫穩(wěn)態(tài)和自身免疫性疾病的發(fā)展中的作用機(jī)制，為在飲食干預(yù)中補(bǔ)充微生物終產(chǎn)物來改善CP/CPPS患者的免疫障礙提供了一個新的視角。

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