上期為大家介紹了組織特異性干貨分享系列之心肌細(xì)胞特異性表達(dá)調(diào)控，那么本期將繼續(xù)進(jìn)行“組織特異性干貨分享”，小編將帶大家一起來了解下脂肪組織特異性表達(dá)調(diào)控。

脂肪組織是機(jī)體中重要的能量?jī)?chǔ)存器官，承擔(dān)著維持體溫、保證代謝的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和保護(hù)身體及內(nèi)臟器官免受機(jī)械沖擊傷害的功能，還是機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官，通過分泌激素和細(xì)胞因子發(fā)揮作用。

圖1 脂肪組織的細(xì)胞群構(gòu)成模式圖

脂肪組織的三分之一是成熟的脂肪細(xì)胞，其余細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞等，統(tǒng)稱為SVF。成熟脂肪細(xì)胞根據(jù)形態(tài)和功能可以分為白色脂肪細(xì)胞，棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞三種。

圖2 脂肪細(xì)胞的分化過程[1]

腺相關(guān)病毒（AAV）是基因治療的重要載體之一，安全性非常高。那么如果用AAV去靶向脂肪細(xì)胞呢？本文將詳細(xì)介紹針對(duì)脂肪不同細(xì)胞，所用的不同的血清型以及組織特異性的啟動(dòng)子，并結(jié)合相關(guān)案例進(jìn)行注射方式的介紹。希望能夠?yàn)樽鱿嚓P(guān)研究的老師們提供一些幫助。

血清型

AAV有很多血清型，AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等血清型被報(bào)道常用于感染脂肪組織。西班牙巴塞羅那大學(xué)的研究者把AAV1、2、4、5、6、7、8、9血清型分別注射到小鼠的脂肪組織，比較其在脂肪組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，發(fā)現(xiàn)AAV8和AAV9血清型在小鼠脂肪組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高[2]。

圖3 不同血清型在脂肪組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況

特異性啟動(dòng)子

表1 脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞組成，包括白色、棕色和米色脂肪細(xì)胞。除脂肪細(xì)胞外，脂肪組織中還含有前脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種免疫細(xì)胞等。因此，不同脂肪細(xì)胞的感染可以借助不同特異性啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。漢恒推出了4種脂肪特異性啟動(dòng)子，幫助您構(gòu)建高效、特異性靶向不同脂肪組織的rAAV載體。

1. FABP4（aP2）脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

脂肪酸結(jié)合蛋白-4（FABP4），又稱脂肪細(xì)胞蛋白2（aP2），是一種在巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中高表達(dá)的脂質(zhì)結(jié)合伴侶蛋白。

南京大學(xué)蔣曉紅教授發(fā)現(xiàn)白色脂肪組織來源的外泌體MiR-222可以促進(jìn)肥胖相關(guān)胰島素抵抗。文章使用了HBAAV2/9-FABP4-3xflag-CD63-EGFP-T2AmCherry（漢恒提供）來分析gWAT的外泌體miR-222的定位。研究結(jié)果表明，mCherry僅在注射了AAV的小鼠的gWAT中表達(dá)[3]。

注射參數(shù)

病毒類型：HBAAV2/9-FABP4-3xflag-CD63-EGFP-T2AmCherry

部位：小鼠腹腔脂肪組織

注射方法：打開腹腔，在脂肪墊內(nèi)多處注射5ul。

病毒滴度2.0x10 viral genomes / mL

8周之后取材檢測(cè)

圖4 活體成像檢測(cè)了mCherry的分布

2. adiponectin脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

人脂聯(lián)素啟動(dòng)子adiponectin是成熟脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。

美國(guó)索爾克生物研究所研究者發(fā)現(xiàn)FGF1和胰島素可以控制脂肪分解[4]。研究者利用免疫印跡證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了用AAV-adiponectin轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠之后的表達(dá)情況，GFP僅在成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)，而在前體脂肪細(xì)胞、肝臟、腎等部位沒有表達(dá)。證明了adiponectin啟動(dòng)子對(duì)成熟脂肪細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

注射參數(shù)

病毒類型：AAV-adiponectin，

AAV-adiponectin-PDE4D-GFP

部位：小鼠性腺脂肪組織

注射方法：尾靜脈或者眼眶后注射，5x10E+11 genomic copies/只?

圖5 熒光顯微鏡及免疫印記驗(yàn)證AAV的組織特異性

3. UCP1棕色脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

甲狀腺激素的兩種形式，甲狀腺素（T4）及其活性代謝物3,5,3?-三碘甲狀腺原氨酸（T3），調(diào)節(jié)控制能量利用的代謝過程。長(zhǎng)期以來，T3一直參與刺激各種組織中的強(qiáng)制性和適應(yīng)性生熱作用。在棕色脂肪組織（BAT），T3通過誘導(dǎo)線粒體解偶聯(lián)蛋白（UCP1）誘導(dǎo)代謝效率低下來刺激產(chǎn)熱。

新加坡國(guó)立大學(xué)研究者發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素（T3）通過線粒體自噬刺激棕色脂肪組織激活。研究者通過將UCP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的cre表達(dá)腺病毒注射到Atg5Flox/Flox小鼠中，生成了Atg5條件敲除小鼠模型（Atg5 cKO），以檢測(cè)BAT特異性自噬對(duì)體內(nèi)產(chǎn)熱的影響。結(jié)果表明Atg5 cKO小鼠的體溫低于正常小鼠，并且跟正常小鼠相比存在蛋白碳基的積累和線粒體變形[5]。

注射參數(shù)

病毒類型：AAV8-UCP1-eGFP，

AAV8-UCP1-iCre

部位：棕色脂肪細(xì)胞（Atg5Flox/ Flox mice）

注射方法：尾靜脈注射；5x10E+11 genomic copies/只?

圖6 BAT特異性自噬抑制

4. Myf5前體脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

肌原性因子5（Myf5），Myf5 Cre細(xì)胞系已被用于生成早期缺失相關(guān)基因的模型，以用于研究棕色脂肪的發(fā)育和功能[6]。

喬治亞州立大學(xué)的研究者脂肪前體細(xì)胞中Dnmt3b缺乏會(huì)促進(jìn)小鼠肥胖。為了確定棕色脂肪Dnmt3b在飲食誘導(dǎo)的肥胖調(diào)節(jié)中的作用，研究者通過將Dnmt3b-floxed （fl/fl）小鼠與Myf5-cre小鼠雜交，建立了棕色脂肪骨骼肌系前體細(xì)胞（3bKO）中Dnmt3b缺失的遺傳模型。3bKO小鼠在棕色脂肪中Dnmt3b mRNA的表達(dá)減少（B）。3bKO的iBAT蛋白水平顯著降低（C），但iWAT、gWAT（E、F）和肝臟（G）中DNMT3b蛋白水平?jīng)]有顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，Myf5+特異性靶向的棕色脂肪前體細(xì)胞中Dnmt3b的缺失促進(jìn)了飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗。

圖7 Myf5啟動(dòng)子特異性驗(yàn)證

注射方式

針對(duì)脂肪組織感染，常采用定點(diǎn)多點(diǎn)注射，其優(yōu)勢(shì)在于降低rAAV載體脫靶效應(yīng)、且病毒用量較少；此外，對(duì)于難感染的內(nèi)臟脂肪或大范圍脂肪感染亦可采用腹腔注射AAV來實(shí)現(xiàn)。大家可以關(guān)注漢恒生物公眾號(hào)獲取動(dòng)物注射視頻資料。

參考文獻(xiàn)：

1. Ref: Brestoff, Jonathan & Artis, David. (2015). Immune Regulation of Metabolic Homeostasis in Health and Disease. Cell. 161. 146-160. 10.1016/j.cell.2015.02.022.

2. Jimenez, V., Mu?oz, S., Casana, E., Mallol, C., Elias, I., Jambrina, C., Ribera, A., Ferre, T., Franckhauser, S., and Bosch, F. (2013). In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes 62, 4012–4022.

3. Yujing Zhang, Jing Li, Xiaohong Jiang et al. Gonadal white adipose tissue-derived exosomal MiR-222 promotes obesity-associated insulin resistance. AGING 2020, Vol. 12, No. 22.

4. Gencer Sancar, Sihao Liu, Emanuel Gasser et al. FGF1 and insulin control lipolysis by convergent Pathways.2022, Cell Metabolism 34, 171–183.doi.org/10.1016/j.cmet.2021.12.004.

5. Paul M. Yen, Lei Sun et al. Thyroid hormone (T3) stimulates brown adipose tissue activation via mitochondrial biogenesis and MTOR-mediated mitophagy. RESEARCH PAPER - BASIC SCIENCE. 2019, VOL. 15, NO. 1, 131–150. doi.org/10.1080/15548627.2018.1511263.

6. Wang, S.; Cao, Q.; Cui, X.; Jing, J.; Li, F.; Shi, H.; Xue, B.; Shi, H. Dnmt3b Defificiency in Myf5+ -Brown Fat Precursor Cells Promotes Obesity in Female Mice. Biomolecules 2021, 11, 1087. doi.org/10.3390 /biom11081087.