最近有同學(xué)要做染色了，咨詢我該買什么抗體，抗體官網(wǎng)一個指標(biāo)竟然搜出來幾十種抗體，完全分不清楚，所以今天出一期教程，手把手教你選抗體，這樣老板就再也不用擔(dān)心我會買錯抗體啦！

抗體結(jié)構(gòu)

選抗體前當(dāng)然要對抗體的基本結(jié)構(gòu)有所了解，抗體，又名免疫球蛋白 (Ig)，是一種由 B 細(xì)胞產(chǎn)生的大型 Y 形糖蛋白，可在免疫防御中起主要作用?？贵w與病原體的特定分子（即抗原）發(fā)生特異性結(jié)合。

抗體以一個或者多個 Y 形單體存在，每個 Y 形單體由 4 條多肽鏈組成（圖 1）。每個 Y 形單體包含兩條相同的重鏈（H）和兩條相同的輕鏈（L），重鏈和輕鏈的序列和長度不同。Y 形單體的頂部包含可變區(qū)（V），也稱抗原結(jié)合片段（F(ab)）區(qū)。該區(qū)可與給定抗原上的表位特異性緊密結(jié)合。

抗體的基本結(jié)構(gòu)包含恒定區(qū)（C）和可結(jié)晶片段（Fc）區(qū)。這一區(qū)域?qū)贵w的免疫應(yīng)答功能非常重要。此外，將熒光染料和酶經(jīng)共價鍵連接到抗體的 Fc 部位，可實現(xiàn)實驗的可視化。

***圖 1.抗體結(jié)構(gòu)。*Y 形抗體通過彈性的鉸鏈區(qū)連接到中部?？乖Y(jié)合發(fā)生在由免疫球蛋白重鏈（H）和輕鏈（L）組成的可變區(qū)（V）?？贵w的基本結(jié)構(gòu)由恒定區(qū)（C）組成。

根據(jù)多肽序列的微小差異，抗體的輕鏈都可分為 kappa (κ) 型或 lambda (λ) 型。重鏈結(jié)構(gòu)決定了各個抗體的總類。

哺乳動物體內(nèi)的抗體分為 5 種同種型：IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。如圖 2 所示，各個同種型都有其獨特的結(jié)構(gòu)。這些同種型因 Y 形結(jié)構(gòu)的數(shù)量和重鏈種類而異。它們的生物學(xué)特性、功能區(qū)域以及結(jié)合不同抗原的能力有所不同。

?圖 2.抗體結(jié)構(gòu)及同種型。

單克隆與多克隆

多克?。?*Polyclonal）**抗體（pAb）是一種異型抗體混合物，其中的抗體來源于多個 B 細(xì)胞的免疫應(yīng)答過程，并且每種抗體均可識別同一抗原的不同表位。由于多克隆抗體可檢測蛋白上的一系列表位，因此與單克隆抗體相比，它們批間變異的風(fēng)險更高。但是，由于多克隆抗體對單一表位不存在特異性，因此與單克隆抗體相比，它們對抗原微小變化的寬容性更強(qiáng)。

單克?。∕onoclonal）抗體（mAb）由單個 B 細(xì)胞親本克隆產(chǎn)生，因此，只能識別單個抗原的一個表位。單克隆抗體對靶向的抗原表位具有高度特異性，非特異性交叉反應(yīng)性低，批間變異很小。

如何選擇抗體

應(yīng)用實驗

首先根據(jù)自己要做的實驗來篩選，有的抗體能應(yīng)用很多實驗，有的抗體則只能用于某一兩個實驗。

常見實驗簡寫：IHC-P免疫組化石蠟切片、IHC-F免疫組化冰凍切片、mIHC多色熒光免疫組化、IF免疫熒光、ICC免疫細(xì)胞化學(xué)、WB(WesternBlot）蛋白質(zhì)印跡試驗、Flow Cyt (Intra)流式、IP免疫沉淀、ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗。

標(biāo)記方式（偶聯(lián)物）

偶聯(lián)物從最終的圖像采集來分可分為白光和熒光；

常見白光偶聯(lián)物有：Biotin生物素、HRP辣根過氧化物酶、AKP堿性磷酸酶。

常見熒光偶聯(lián)物有：Fitc、Cy3、Cy5、AF488、AF555、AF647；具體顏色通道見下圖。

注意現(xiàn)在常用的偶聯(lián)物是偶聯(lián)在二抗上的，但是一抗的選擇決定了能不能用于某種偶聯(lián)物的二抗。

應(yīng)用種屬

接著根據(jù)你的實驗樣本來選擇一抗，通常一抗的適用種屬都有三種Mouse、Rat、Human，但有的適用于其中一種或兩種，看清楚了，這將決定你的實驗的成敗。

來源種屬

通常一抗的來源種屬有Rabbit和Mouse，二抗的來源種屬有山羊和驢。

這里要注意的是避免種屬間的交叉反應(yīng)造成的假陽性，比如樣本是小鼠的，一抗盡量用兔抗，不要用鼠抗，不然山羊抗小鼠二抗有可能會和樣本中的某些蛋白發(fā)生非特異性反應(yīng)，進(jìn)而造成假陽性。

克隆號、表位

篩選到這里已經(jīng)能排除掉很大一部分抗體了，如果不是有特殊的需求，到這里就可以從篩選結(jié)果里隨意的選擇了。

但有些抗體后面會有一些（）和【】，分別是什么意思呢？

（）里的是抗原表位，如果對免疫原有要求，就需要選擇特別的抗體。例如，sp克隆系列中BRAF抗體(ab228461)可以識別V600E 突變的BRAF蛋白，可用于檢測發(fā)生突變且活化的 BRAF 蛋白質(zhì)。

【】的是克隆號，是抗體研發(fā)中細(xì)胞株的編號，一般單克隆才會有這個號，這個不用特別關(guān)心，知道是什么就行。

其他一些特殊標(biāo)記

靶點名稱前面有Phospho表示磷酸化，磷酸化后面都有一個（），里面寫的是磷酸化的位點，比如Akt主要有兩個重要的磷酸化位點Thr308和Ser473。

靶點名稱前面加pan，表示該抗體可以檢測該靶點的所有亞型。

重組抗體是什么？

重組抗體，也稱為基因工程抗體，是指通過DNA重組技術(shù)將抗體相應(yīng)的基因序列根據(jù)需要進(jìn)行改造和重組，并構(gòu)建在質(zhì)粒上，再通過蛋白外源表達(dá)技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化入適合的宿主細(xì)胞表達(dá)獲得的抗體。屬于第三代抗體制備技術(shù)，優(yōu)點是不會遭受與傳統(tǒng)單克隆抗體相同的遺傳漂移，從而確保了批次之間的一致性和質(zhì)量。

其他知識點

濃度

廠家推薦濃度一般為一個區(qū)間，可以在正式實驗前設(shè)置3-5個濃度梯度，做一次預(yù)實驗，選擇一個最佳濃度做正式實驗。

修復(fù)方式

廠家一般會推薦一個修復(fù)方式，根據(jù)不同實驗和組織選擇即可，一般有EDTA9.0、EDTA8.0、檸檬酸鈉（枸櫞酸）6.0。

細(xì)胞定位

抗體廠家大部分會告訴你亞細(xì)胞定位，就是靶蛋白的表達(dá)位置，知道在哪里表達(dá)，可以作為實驗時排除假陽性的參考。

二抗后的（H+L）

H表示重鏈，L表示輕鏈。（H+L）表示用靶標(biāo)蛋白分子的重鏈和輕鏈來免疫兔子產(chǎn)生的抗體。

購買

抗體可以直接從官網(wǎng)購買，也可以從我們這種實驗室購買，可以走渠道價，有個8-9折優(yōu)惠，需要的可以文末微信。

實際問題

1、有時候抗體官網(wǎng)會有沒測試過的種屬或?qū)嶒?，預(yù)測可用于某某種屬，這個時候是用還是不用呢？

我的建議是如果實在是沒有找到測試過的抗體可以買，那就可以用。

2、官網(wǎng)適用實驗沒有自己要做的實驗或濃度怎么辦？

有的只有IHC或IF其中一個實驗的推薦濃度，這個時候就可以把二者互用。

還有的時候是只有WB沒有IHC，可以將WB的濃度縮小1000倍用于IHC。

以上兩種情況，我是實際做過的，可以做出來，其他沒做過。

抗體使用保存

收到

收到新抗體后首先要做的是：對裝有抗體的小瓶進(jìn)行離心。運輸過程中，瓶內(nèi)液體發(fā)生晃動，因此會有液體滯留在蓋子上。將小瓶放在離心機(jī)上快速離心（10,000 xg，20 秒），可以確保珍貴的抗體回落到小瓶底部，以確保抗體全部可用。

存儲

關(guān)于儲存，請記住，反復(fù)凍融可使抗體變性，使其形成聚合物，從而降低抗體的結(jié)合能力。下面關(guān)于原液和工作液存儲方式逐個說明。

原液（儲存液）：一般標(biāo)注存儲-20°的會含有甘油，放-20不會凍住，標(biāo)注存儲-4°的放4°就行，放-20°會凍住。

工作液：按比例稀釋后沒用完或回收的工作液，放4°即可，不要放-20°。如果想長時間保存，稀釋液里應(yīng)該加抑菌防腐劑，但最好不要加疊氮化鈉，因為會影響HRP的活性，而且會對大部分生物體都有毒害作用，可以使用proclin。稀釋液加了抑菌防腐劑，2個月內(nèi)用沒什么影響。

避免使用無霜冰箱，抗體應(yīng)該放置于冰箱中溫度變化最小的部位，如應(yīng)放置于冰箱格里，而不應(yīng)放置于冰箱門上。

對照設(shè)置

陽性對照：抗體官網(wǎng)都會告訴你什么組織或細(xì)胞是陽性對照，可以在做實驗時用同樣濃度做一張，假如最后樣本靶標(biāo)蛋白的結(jié)果呈陰性，陽性對照呈陽性，這就說明試劑和實驗操作是沒問題的，可能組織不表達(dá)靶標(biāo)單標(biāo)。如果陽性對照也呈陰性，說明試劑或?qū)嶒灢僮魇怯袉栴}的。

陰性對照：可以用PBS替代一抗，其他不變。如果陰性對照呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明結(jié)果是假陽性。實驗操作或試劑應(yīng)該有問題。

以上就是小諾關(guān)于選擇抗體的一些經(jīng)驗分享，歡迎加微信交流，一起學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步！

當(dāng)然，看完如果有收獲，也歡迎關(guān)注轉(zhuǎn)發(fā)，我是小諾，一個講干貨的實驗員！咱們下期見！

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免責(zé)聲明

本方案僅用于科研實驗，不適用于臨床。