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中國科大張凱銘團隊解析人源m6A甲基化酶復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

在RNA上存在多種修飾，其中腺嘌呤N6位甲基化（m6A）修飾是哺乳動物中豐度最高、分布最廣的RNA修飾。研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在mRNA的編碼區(qū)和3’ -UTR區(qū)域富集，參與多種生理及病理過程的調(diào)控。RNA的m6A修飾依賴由多個蛋白成員組成的m6A甲基化酶完全復(fù)合物（Holo-complex），其中由MT-A70家族蛋白METTL3和METTL14形成異源二聚體組成的催化亞基被稱作m6A-METTL復(fù)合物（m6A-METTL complex,簡稱MAC）；而WTAP、VIRMA（KIAA1942）、ZC3H13和HAKAI等主要起調(diào)控作用，并存在明顯的相互作用，它們組成的調(diào)控亞基被稱作m6A-METTL關(guān)聯(lián)復(fù)合物（m6A-METTL associated complex,簡稱為MACOM）（圖1a）。缺少MACOM時，MAC只顯示相對較低的體外m6A修飾活性（圖1c），因此MACOM對MAC的m6A甲基化酶活性具有重要的調(diào)控作用。雖然組成MAC核心的METTL3/14催化結(jié)構(gòu)域以及METTL3的鋅指結(jié)構(gòu)已被解析1-4，但是對于調(diào)控復(fù)合物MACOM及其成員蛋白，仍缺乏任何結(jié)構(gòu)信息，極大阻礙了對其功能和對催化亞基MAC活性的調(diào)控機制研究。

圖1. MAC-MACOM的活性測試及MACOM復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。a, MAC-MACOM進行RNA m6A甲基化修飾的工作模型。b,c, MAC, HWVZ, MAC-HWVZ復(fù)合物尺寸排阻色譜峰圖以及對應(yīng)SDS-PAGE電泳圖。d,使用Actb-1 RNA來比較單獨MAC及其與不同組分MACOM復(fù)合物組合的m6A甲基化活性。e,所用人源MACOM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域示意圖。虛線代表電鏡結(jié)構(gòu)中不可見的區(qū)域。f, HWVZ復(fù)合物的電鏡密度（左）與結(jié)構(gòu)（右）示意圖。g, HWV復(fù)合物的電鏡密度（左）與結(jié)構(gòu)（右）示意圖。

2022年9月27日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部張凱銘團隊與復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院麻錦彪團隊和合作在Cell Research雜志在線發(fā)表了題為《Cryo-EM structures of human m6A writer complexes》的文章，該研究首先體外獲得了MACOM和MAC復(fù)合物（圖1b-c），然后通過冷凍電鏡解析了兩套分辨率在3.0 ?的人源m6A甲基化酶調(diào)控亞基復(fù)合物MACOM的核心區(qū)域原子水平結(jié)構(gòu)（圖1f-g），以及整體分辨率為4.4 ?的人源m6A甲基化酶MAC-MACOM復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)。研究團隊結(jié)合蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)質(zhì)譜以及pull-down等生化實驗與結(jié)構(gòu)分析，闡明了MACOM復(fù)合物結(jié)構(gòu)核心區(qū)域的組成及結(jié)構(gòu)細節(jié)，并提出了MAC-MACOM甲基化修飾RNA的合理模型。

解析的MACOM復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)整體形狀類似“披戴馬鞍的戰(zhàn)馬”。其中WTAP通過四段α-螺旋卷曲螺旋（coiled-coil）H1-H4形成了緊密的同源二聚體，H1-H4之間有三處linker區(qū)域鏈接并扭轉(zhuǎn)（圖2a），使得WTAP二聚體形成類似馬鞍的形狀。VIRMA則以20個ARM-like重復(fù)結(jié)構(gòu)單元通過長連接螺旋等形成類似半身馬型結(jié)構(gòu)（圖2b）。WTAP二聚體和VIRMA之間超過5000 ?2的相互作用界面以及保守、多模式、多區(qū)域的相互作用，使得二者緊密的結(jié)合，作為整個m6A甲基化酶復(fù)合物調(diào)控亞基的剛性骨架（圖2c）。ZC3H13通過C端片段（1492-1643aa）深入結(jié)合在VIRMA的中心部分從而錨定在復(fù)合物上，并把VIRMA“撐開”6 ?左右的開口（圖2d-e）。值得指出的是，雖然HAKAI在復(fù)合物純化過程中一直存在，但在兩個MACOM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中都并未觀察到（圖1），因此HAKAI并不構(gòu)成調(diào)控亞基的核心結(jié)構(gòu)，很可能結(jié)合在外圍靈活區(qū)域。

圖2. WTAP、VIRMA、ZC3H13的結(jié)構(gòu)及作用關(guān)系。a, WTAP的二聚體結(jié)構(gòu)示意圖。α-螺旋卷曲螺旋的軸用黑線表示。b, VIRMA的結(jié)構(gòu)示意圖。c, VIRMA的序列保守性示意圖。WTAP與VIRMA相互作用的區(qū)域已用框標(biāo)出。WTAP和ZC3H13均為半透明表示。d,e,以VIRMA的Belly和Chest結(jié)構(gòu)域為參考，ZC3H13結(jié)合后HWV復(fù)合物的構(gòu)象變化。e, ZC3H13的α6和α7結(jié)合導(dǎo)致的HWV復(fù)合物構(gòu)象變化的模型。

為了獲得m6A甲基化全酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，研究人員進一步解析了4.4 ?的MAC-MACOM復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其中MACOM復(fù)合物部分較清晰，而MAC部分密度較差，無法清晰辨識。但在WTAP-H4/H4’區(qū)域，出現(xiàn)了的高占有率α-螺旋密度（圖3a），通過蛋白交聯(lián)質(zhì)譜與pull-down實驗證明，此處的密度為METTL3 N端的Leader Helix，與此前報道的生化結(jié)果一致5。再通過調(diào)低冷凍電鏡密度閾值，借助已解析的METTL3/14核心晶體結(jié)構(gòu)和鋅指溶液結(jié)構(gòu)1-4，搭建出了MAC-MACOM復(fù)合物中兩個亞基的相對空間關(guān)系（圖3b，同時通過分析s4U標(biāo)記的RNA底物與MAC-MACOM復(fù)合物的交聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果，確定了RNA底物在MAC-MACOM復(fù)合物上的結(jié)合區(qū)域，提出了可能的m6A甲基化酶復(fù)合物修飾RNA底物的作用模型（圖3c）。

圖3. MAC與MACOM復(fù)合物的相互作用以及整體的底物結(jié)合模式圖。a,在高閾值下的MAC-MACOM復(fù)合物電鏡密度中放入MACOM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，多余密度用虛線圈出。b,基于電鏡密度和生化結(jié)果的MAC-MACOM復(fù)合物模型，左圖為高閾值密度圖，右圖為低閾值密度圖。c,根據(jù)s4U-RNA和MAC-MACOM復(fù)合物的交聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果提出的m6A甲基化酶復(fù)合物與RNA底物的作用模型。

總之，該研究首次解析了m6A修飾過程中其重要調(diào)控作用的MACOM復(fù)合物的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和全酶復(fù)合物（MAC+MACOM）核心結(jié)構(gòu)模型，并進一步提出了合理的m6A甲基化酶復(fù)合物修飾RNA底物的作用模型。由此為開發(fā)針對m6A修飾的抑制劑或藥物提供了除MAC催化亞基復(fù)合物以外的新靶點的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以實現(xiàn)對RNA m6A修飾相關(guān)癌癥等人類疾病的潛在治療目的。

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的蘇世晨博士、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部的李珊珊副研究員以及復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的博士生鄧婷為本文共同第一作者，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和遺傳工程國家重點實驗室麻錦彪教授與中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部張凱銘研究員為本文的共同通訊作者。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)細胞動力學(xué)重點實驗室和冷凍電鏡中心為數(shù)據(jù)收集與處理提供了支持，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和遺傳工程國家重點實驗室的電鏡平臺為樣品初篩提供了支持。該項研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、中科大科研啟動經(jīng)費和中科院率先行動引才計劃擇優(yōu)經(jīng)費的資助。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-022-00725-8

1Wang, X.et al.Structural basis of N6-adenosine methylation by the METTL3–METTL14 complex.Nature534, 575-578 (2016).

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（生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、科研部）