產(chǎn)品介紹

Frdbio? Fluor熒光染料為活性熒光染料，該系列包括從紫外、可見光譜到近紅外光譜常見熒光染料，用于標(biāo)記生物分子，特別是蛋白質(zhì)和核酸。對核心結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新性修改使得Frdbio? Fluor染料優(yōu)于具有許多創(chuàng)新新穎特征的其他商業(yè)染料，主要表現(xiàn)在標(biāo)記效率更高，發(fā)光度更強。

Frdbio?Fluor488是一種熒光染料，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為494nm和518nm，它與抗體形成更特異的抗體熒光素結(jié)合物，背景較更低;FITC升級產(chǎn)品，主要表現(xiàn)在穩(wěn)定性更好。

基本原理

本試劑盒主要通過熒光素集團的活性鍵與生物分子的游離氨基共價結(jié)合，可以用于標(biāo)記抗體，蛋白。本試劑盒種所提供的熒光染料都為預(yù)先活化干粉，便于長期保存，使用時用試劑盒隨帶的DMSO溶解便可直接用于標(biāo)記實驗，60-90分鐘可以輕松完成標(biāo)記。標(biāo)記產(chǎn)物在含有防腐劑的保存液中可以放置在?4?C至少保存1個月以上，需要長期保存。

本試劑盒常被用于抗體的直接標(biāo)記，省卻了二抗的使用和其所帶來的操作步驟。

試劑盒組分

組分名稱（Components）

型號規(guī)格及其對應(yīng)組分

ARL0520K-200

ARL0520K-500

ARL0520K-1000

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其他規(guī)格可洽定制

可標(biāo)記抗體量

0.2~1.0mg

0.5~2.5mg

1.0~5.0mg

活化Fluor488干粉

使用時加DMSO ? 40ul溶解

使用時加DMSO ? 100ul溶解

使用時加DMSO ? 200ul溶解

DMSO

40ul

100ul

200ul

標(biāo)記緩沖液(Coupling buffer)

10mL

15mL

30mL

標(biāo)記物保存液(Preservation?Buffer)

2.0mL

2mL*2

10mL

純化超濾管:????????????????????????????????????????????? ?

1支

1支

1支

重要提示：

1.????本試劑盒所配置的活化Fluor488熒光染料為干粉，可放置4?C或者-20?C長期保存，使用時加入試劑盒所配的DMSO溶解即可用于標(biāo)記，溶解后的Fluor488熒光染料不可保存下次使用，建議一次性使用完；

2.????本試劑盒所配置的超濾管默認截留30k MWCO,適合于抗體抗體，如果需要標(biāo)記其他分子量蛋白類物質(zhì)請與我們聯(lián)系，給您配置相應(yīng)分子量截留超濾管（您的待標(biāo)記物質(zhì)分子量必須大于超濾管截留分子量的2倍以上）；

3.????本試劑盒所推薦的抗體標(biāo)記量僅供參考，如有更高要求需要實驗者具體摸索優(yōu)化，建議按照推薦最低量進行標(biāo)記實驗。

4.????對待標(biāo)記抗體、蛋白質(zhì)的要求：

ü??待標(biāo)記物以0.01M pH7.4 PBS環(huán)境為佳，不應(yīng)含有甘油、BSA、疊氮鈉、氨基物質(zhì)（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物質(zhì)。如果含有以上小分子物質(zhì)，需用0.01M pH7.4 PBS 緩沖溶液進行充分透析、脫鹽柱脫鹽或者超濾管超濾置換溶液以除去干擾小分子，如果含有保護性蛋白BSA等需要想辦法將其分離去除；

ü??調(diào)整待標(biāo)記物至適當(dāng)?shù)臐舛?，抗體調(diào)整的濃度為2-10mg/mL為宜；對于小分子物質(zhì)需要實驗者摸索濃度，保證熒光素的比例過量。

ü??最佳標(biāo)記反應(yīng)條件為試劑盒所提供的標(biāo)記緩沖液環(huán)境，盡可能在標(biāo)記前將待標(biāo)記物溶液環(huán)境置換為標(biāo)記還緩沖液；

ü??如果待標(biāo)記物溶液中有不溶物、有塊狀物或者沉淀請離心或者過濾除掉。

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其他需要自備材料：

ü??待標(biāo)記的生物分子

ü??移液器及吸頭.

ü??去離子水.

ü??PBS (pH 7.4)

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試劑盒儲存

試劑盒放在-20?C可保存6個月以上。.

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試劑盒使用操作流程

???試劑準(zhǔn)備

待標(biāo)記的生物分子與熒光素最佳摩爾比例為1:8-1:22,本試劑盒推薦最佳比例為1:15（按照本試劑盒操作熒光素干粉加入相應(yīng)量DMSO溶解后的熒光素濃度770uM(nmol/ml),通常1mg/ml抗體(分子量150kDa)的濃度為6.67uM(nmol/ml)；?為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預(yù)實驗進行摸索。以抗體標(biāo)記為例，推薦量如下。最佳標(biāo)記體系應(yīng)保證抗體的濃度為2mg/ml，標(biāo)記時終濃度不低于1mg/ml。對于其他標(biāo)記量，參照表按等比例調(diào)整抗體的體積和用量。

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???樣品準(zhǔn)備

待標(biāo)記的分子濃度不低于2 mg/ml，如果濃度較低，需在實驗之前濃縮到2mg/ml以上；待標(biāo)記的分子需要溶解在符合以下要求的緩沖液中，如果符合以下要求可以直接進行標(biāo)記，如果不符合請將溶液置換（透析或者超濾）到符合要求的溶液中在進行標(biāo)記實驗。

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pH

6.5-8.0

不含游離氨基

MES, PBS, HEPES

螯合劑 (e.g. EDTA)

ü

甘油

< 5%

牛血清白蛋白

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甘氨酸

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含氨基組分

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?

?

???操作流程(以標(biāo)記100ug抗體為例,2mg/ml)

1)???將待標(biāo)記抗體溶液置換成標(biāo)記緩沖液，或者加入1/10體積標(biāo)記緩沖液，用移液器輕輕混勻；

2)???取20ul(按照抗體與熒光素摩爾比=1:23)活化的Fluor488溶液加入到上述步驟混勻的抗體中，輕輕混勻，37℃ 避光反應(yīng)1小時；

3)???反應(yīng)完畢，將適量的PBS（約450uL）加入到步驟2)的混合溶液中，輕輕混勻并將溶液移至超濾管芯，4℃ 12000離心5min；

4)???離心完畢，取出管芯將外套管內(nèi)溶液棄掉，管芯重新插入外套管，在管芯內(nèi)重新加入適量的PBS（約450uL）4℃ 12000離心5min；

5)???重復(fù)步驟4）5次以上；

6)???將超濾管芯內(nèi)溶液輕輕混勻并吹打管心內(nèi)壁，并轉(zhuǎn)移到干凈避光離心管，此即為熒光素標(biāo)記產(chǎn)物。

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???標(biāo)記產(chǎn)物的保存

根據(jù)實驗需要調(diào)整到合適的濃度，可加入適量BSA，甘油及防腐劑等，分裝成小分-20℃避光保存；也可以將試劑盒附帶的標(biāo)記物保存液與標(biāo)記產(chǎn)物按照體積比1：1混勻后，即可分裝保存。

?Flour 488標(biāo)記蛋白F/P值計算：

1）用PBS?精確倍數(shù)稀釋定量的少許純化過的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和494nm的光吸收；

2）計算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A494×0.11))×稀釋倍數(shù)/203000

3）計算標(biāo)記比例：?每摩爾蛋白結(jié)合的染料摩爾數(shù)=A494×稀釋倍數(shù)/(71000×蛋白摩爾濃度)

常見問題及解決辦法

Q:?待標(biāo)記分子經(jīng)過濃縮濃度仍然達不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?

A:?標(biāo)記的時候盡可能達到這個濃度，如果實在達不到這個濃度，適當(dāng)增加加入的活化的熒光素的量；最佳標(biāo)記效果可以梯度增加熒光素用量試驗測試來確定。

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Q:?待標(biāo)記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？

A:?這個要根據(jù)不同生物分子性質(zhì)確定，更準(zhǔn)確的說與生物分子表面氨基個數(shù)有關(guān)系；最佳標(biāo)記比例可根據(jù)梯度用量測試確定。

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Q:?如果選擇標(biāo)記試劑盒中的超濾管型號?

A:?一般來說，您待標(biāo)記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標(biāo)記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標(biāo)記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化

Q:標(biāo)記效率低

A:有以下原因：

1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應(yīng)降低了標(biāo)記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標(biāo)記前用PBS透析。

? ? ?2）蛋白含量較低?(≤1 mg/mL)會影響標(biāo)記效率。

3）標(biāo)記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應(yīng)混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標(biāo)記反應(yīng)的效率最高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調(diào)節(jié)至最適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1 M碳酸氫鈉透析等。

4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標(biāo)記效率和標(biāo)記速度（只需10min）明顯改善。

5）不同抗體與熒光團的反應(yīng)速率不同，染料標(biāo)記后保留的生物活性程度也不同，因此標(biāo)準(zhǔn)步驟也不是總有最好的標(biāo)記結(jié)果。為增加標(biāo)記率，可以對同一樣品進行再標(biāo)記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標(biāo)記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。