USP3嚴(yán)格調(diào)控泛素介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答以維持造血干細(xì)胞功能的完整性
寫在前面
????????今天推薦的是由荷蘭癌癥研究所團(tuán)隊(duì)在2014年8月25日發(fā)表于Journal of Experimental Medicine(IF:11.142,JCR 1區(qū))的一篇文章,通訊作者是Elisabetta Citterio教授,研究表明USP3通過調(diào)控泛素介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答可以維持造血干細(xì)胞功能的完整性。
研究背景
????????保持基因組的完整性對生理過程至關(guān)重要,包括干細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)以及腫瘤的避免。為了保護(hù)基因組免受各類遺傳毒素的持續(xù)攻擊,細(xì)胞進(jìn)化出了高效的機(jī)制,統(tǒng)稱為DNA損傷應(yīng)答(DDR)。USP3是一種染色質(zhì)相關(guān)的去泛素酶(DUBs),先前發(fā)現(xiàn)其在逆轉(zhuǎn)組蛋白H2A和H2B的單泛素化方面具有高度活性。目前有幾項(xiàng)研究表明USP3的活性與DDR相關(guān)。DNA斷裂時(shí)的組蛋白泛素化是激活DDR和DNA修復(fù)所必需的。DUBs在體內(nèi)在是如何動態(tài)去除這種修飾,從而影響基因組的完整性,目前還不得而知。
摘要部分
????????作者構(gòu)建了一株USP3缺失的小鼠Usp3 ?/?,結(jié)果發(fā)現(xiàn),USP3的缺失增加了成年組織中組蛋白的泛素化水平,隨著時(shí)間推移還減少了造血干細(xì)胞(HSC)儲備,并縮短了動物壽命。作者的數(shù)據(jù)表明,USP3在維持HSC的穩(wěn)態(tài)、自我更新、體內(nèi)再生潛能和體外增殖方面具有重要作用。缺陷的DDR和未解決的自發(fā)性DNA損傷導(dǎo)致Usp3 ?/?-HSCs的細(xì)胞周期受限。除了造血系統(tǒng)外,Usp3 ?/?小鼠還自發(fā)形成腫瘤,而原代Usp3 ?/?細(xì)胞未能保持染色體的完整性。研究表明,染色質(zhì)泛素化的調(diào)控通過調(diào)節(jié)遺傳毒性應(yīng)激的反應(yīng)以維持組織功能。
研究內(nèi)容
1.USP3缺失的小鼠出生后正常發(fā)育但其全基因組中H2A和H2B的單泛素化增加
????????為研究USP3的生物學(xué)作用,作者構(gòu)建了一株USP3缺失的小鼠(Usp3 ?/?)并在蛋白和mRNA水平上分別驗(yàn)證了USP3的缺失。結(jié)果顯示,Usp3 ?/?幼鼠正常出生且符合孟德爾比例,無明顯的異常表型。?

????????作者使用泛素化底物FK2的抗體進(jìn)行免疫熒光分析。實(shí)驗(yàn)顯示,Usp3?/?-MEF細(xì)胞中的FK2信號強(qiáng)于WT。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與WT相比,Usp3?/?-MEF中單泛素化的組蛋白H2A(uH2A)和H2B(uH2B)水平更高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明染色質(zhì)結(jié)合的FK2的Ub信號和uH2A/uH2B水平增強(qiáng)。

研究結(jié)論:USP3對于胚胎和出生后的正常發(fā)育是不必要的,但它對于抑制uH2A和uH2B在成體組織中的累積是必要的。
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2.USP3缺失導(dǎo)致小鼠壽命縮短、癌癥發(fā)病率升高以及MEFs出現(xiàn)自發(fā)的遺傳毒性應(yīng)激??? ?
????????作者監(jiān)測了Usp3 ?/?(n=34)和WT(n=26)小鼠直到90周齡。結(jié)果顯示,與WT相比,Usp3 ?/?小鼠的壽命明顯縮短且其成體組織功能下降。此外,在34只Usp3?/?小鼠中,有11只產(chǎn)生了自發(fā)性腫瘤,表明Usp3 ?/?小鼠的無瘤存活率顯著降低。? ? ?
????????接著作者探究了USP3缺失對基因組完整性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT相比,Usp3 ?/?-MEF中DNA的自發(fā)性斷裂顯著增加了,染色體斷裂和結(jié)構(gòu)異常也有增加。
????????姐妹染色單體交換(SCEs)的頻率是染色體不穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。作者將WT和Usp3 ?/?-MEFs中的p53敲除(shp53 MEFs)來實(shí)現(xiàn)永生化。實(shí)驗(yàn)表明,Usp3 ?/?-shp53 MEFs中自發(fā)的SCE頻率顯著高于WT。

研究結(jié)論:Usp3 ?/?小鼠更容易出現(xiàn)組織功能衰退和自發(fā)性腫瘤。此外,USP3在維持基因組完整性中發(fā)揮重要作用,其功能的缺陷與遺傳毒性應(yīng)激密切相關(guān)。
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3.USP3缺失的小鼠隨著年齡增長出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少癥
????????作者著手研究USP3缺陷對造血功能的影響。作者分析了10-17以及44周齡(老年)小鼠的外周血。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Usp3 ?/?老齡小鼠的白細(xì)胞(WBCs)數(shù)量與同籠WT小鼠相比顯著減少,這表明Usp3 ?/?小鼠的造血系統(tǒng)中存在年齡相關(guān)的細(xì)胞減少現(xiàn)象,特別是淋巴細(xì)胞。

????????接下來,作者通過流式細(xì)胞術(shù)對結(jié)果就進(jìn)行量化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Usp3 ?/?小鼠的BM(骨髓)中顯示出不均衡的造血。FACS分析顯示,老年Usp3 ?/?小鼠的淋巴室(CD19+)顯著減少,而17周齡的Usp3 ?/?小鼠并沒有。另外,所有B細(xì)胞亞群僅在老年的Usp3 ?/?小鼠中有相當(dāng)水平的減少。

?研究結(jié)論:USP3的缺失顯著影響造血功能,特別是導(dǎo)致B和T淋巴細(xì)胞系出現(xiàn)年齡依賴性的減少。
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4.Usp3 ?/?小鼠的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞室出現(xiàn)質(zhì)和量的缺陷? ? ?
????????作者對17和44周齡小鼠的LSK區(qū)室(富含HSCs)進(jìn)行多參數(shù)流式實(shí)驗(yàn)。分析顯示,Usp3 ?/?小鼠在兩個(gè)年齡段的LSK數(shù)量都顯著減少。進(jìn)一步的研究表明USP3是維持該區(qū)室表型正常所必需的。? ? ?
????????LSK區(qū)室包括長期的LT-HSC、短期的ST-HSC亞群以及多能祖細(xì)胞(MPPs)。作者發(fā)現(xiàn),USP3缺失導(dǎo)致老年小鼠中的三個(gè)原始細(xì)胞群的絕對數(shù)量顯著降低。相反,17周齡的Usp3 ?/?小鼠僅顯示出ST-HSC和MPP減少。此外,USP3缺失導(dǎo)致17周齡時(shí)的普通淋巴祖細(xì)胞(CLPs)顯著減少,而CMPs、GMPs或MEPs的數(shù)量變化很小。

研究結(jié)論:USP3的缺失對HSC、LSK和CLP區(qū)室的大小有顯著影響,且這種影響隨著年齡增長而加大。表明USP3是維持成體中HSC的正常功能所必需的。
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5.USP3缺陷的HSCs表現(xiàn)出細(xì)胞自主性功能衰退? ? ?
????????作者通過小鼠的輻射-移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與WT供體相比,Usp3 ?/??BM細(xì)胞的重建能力有中度但顯著的降低,但Usp3 ?/?供體對重建淋巴B和T譜系的作用很小。此外,在12 wpt時(shí),Usp3 ?/??BM次級受體的LSK群體比WT顯著減少。? ? ?
????????作者將小鼠暴露于5-FU的環(huán)境中并探究應(yīng)激誘導(dǎo)的造血過程中HSCs的穩(wěn)態(tài)。結(jié)果顯示,任何年齡的Usp3 ?/?小鼠中均沒有檢測到BM細(xì)胞減少,然而連續(xù)注射5-FU的條件下,老年Usp3?/?小鼠的BM重建能力出現(xiàn)缺陷。
????????最后作者進(jìn)行了LTC-IC實(shí)驗(yàn)。作者從15-17周齡的Usp3 ?/?和WT小鼠中純化了Lin—·細(xì)胞。長期培養(yǎng)后,Usp3?/?的Lin-細(xì)胞在甲基纖維素中的克隆形成能力顯著降低,表明Usp3?/?原始造血細(xì)胞的活性降低。

研究結(jié)論:無論是穩(wěn)態(tài)條件還是應(yīng)激誘導(dǎo)的造血過程中,USP3對HSCs的細(xì)胞自主性功能十分關(guān)鍵。
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6.USP3缺陷的HSCs在體內(nèi)外均遭受更大的DNA損傷? ? ?
????????作者對DDR激活標(biāo)記物H2AX進(jìn)行免疫染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Usp3?/?的LT-HSC和ST-HSC中顯示出很高的H2AX陽性且有多個(gè)集落,而WT HSCs中很少。? ? ? ?
????????作者進(jìn)行堿性彗星試驗(yàn)以檢測DNA斷裂。結(jié)果顯示,老齡Usp3 ?/?小鼠的LSK和BM細(xì)胞中檢測到明顯更高比例的彗星尾,反映了DNA斷裂的累積。
????????接下來作者探究了Usp3?/? HSCs在壓力誘導(dǎo)的強(qiáng)制增殖中是否發(fā)生DNA損傷。對H2AX和53BP1克隆的分析表明,Usp3?/? LT-HSCs中DNA損傷增加。另外,DAPI分析顯示Usp3?/? LT-HSCs中微核率較高,微核形成是遺傳毒性應(yīng)激的標(biāo)志物。

研究結(jié)論:USP3在維持HSCs的基因組完整性中起著不可或缺的作用。
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7.細(xì)胞衰老是Usp3?/?-BM缺陷的基礎(chǔ)? ? ?
????????作者在BM細(xì)胞上檢測衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性。結(jié)果顯示,與WT相比,Usp3?/?的SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞增加了6.5倍。免疫染色顯示,異染色質(zhì)標(biāo)記物H3K9me3和異染色質(zhì)蛋白1Υ(HP1Υ)在Usp3?/?-LSK中高表達(dá)和局部富集,Usp3?/?-BM中也是如此。這些表明,USP3缺失的LSK和BM細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的異染色質(zhì)作用和SA-β-gal活性。
????????然后作者探究細(xì)胞因子誘導(dǎo)的復(fù)制對LT-HSCs的影響。實(shí)驗(yàn)顯示,WT LT-HSC正常擴(kuò)增,而Usp3?/?細(xì)胞表現(xiàn)出有限的分裂,傳代后更明顯,且隨后異染色質(zhì)增加。最后為了檢測復(fù)制應(yīng)激對LT-HSC的影響,作者將細(xì)胞暴露于c-Myc。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Usp3?/? LT-HSC在Myc表達(dá)時(shí)SA-β-gal的活性明顯更高。

?研究結(jié)論:Usp3?/?-HSCs在細(xì)胞因子和癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激條件下進(jìn)行細(xì)胞周期限制。
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8.USP3保護(hù)HSCs和小鼠免受IR
????????作者測試了USP3 ?/?小鼠在IR后從急性遺傳毒性應(yīng)激中恢復(fù)的能力。結(jié)果顯示,輻射后的USP3 ?/?小鼠在第9天左右體重降低,并在第10-16天全部死亡。而60%的WT小鼠存活下來。
????????作者還分析了LT-HSC在體外對IR的反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn),WT和Usp3?/? HSCs在接受2Gy輻射后表現(xiàn)出類似H2AX和53BP1集落形成。然而,在IR后24 h,盡管絕大多數(shù)IRIF在WT細(xì)胞中被消除,但在Usp3?/?細(xì)胞中仍存在相當(dāng)一部分H2AX和53BP1集落,這表明DSB修復(fù)延遲,且伴隨著微核數(shù)量的增加。

研究結(jié)論:USP3缺陷的HSCs在體內(nèi)外對遺傳毒性應(yīng)激更為敏感。USP3是體內(nèi)DDRs過程中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白
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結(jié)論與討論
????????作者研究了USP3在體內(nèi)功能喪失的結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)去泛素化對于維持生理?xiàng)l件和應(yīng)激反應(yīng)下的組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究表明,體內(nèi)的去泛素化和泛素化在抑制遺傳毒性應(yīng)激的過程中同樣重要??傊?,USP3缺失的小鼠模型證實(shí)了USP3在抑制慢性遺傳毒性應(yīng)激和HSCs衰老方面的重要性。此外,作者還強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)去泛素化的分子機(jī)制。
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Thank you!
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原文鏈接:https://doi.org/10.1084/jem.20131436