在生命系統(tǒng)中，包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物分子很少獨立工作，在完成生命活動的調(diào)控過程中，分子間的相互作用或是擦肩而過，或是牢牢結(jié)合形成復(fù)合體，其中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）構(gòu)成了無數(shù)的生物途徑和活動機(jī)制的基礎(chǔ)，闡明蛋白質(zhì)如何相互作用有助于對生命機(jī)制的系統(tǒng)理解。今天小編來帶大家總結(jié)一下2種主要的蛋白互作組研究方法。

酵母雙雜交技術(shù)

基于轉(zhuǎn)錄因子重組的Y2H系統(tǒng)是一種最廣泛使用的分子遺傳學(xué)方法之一，用于檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)相互作用，識別兩個已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，并定位結(jié)構(gòu)域相互作用。

技術(shù)流程

• 構(gòu)建相應(yīng)材料的酵母文庫；

• 構(gòu)建誘餌載體；

• 誘餌自激活檢測；

• 篩選文庫中與誘餌互作的蛋白質(zhì)；

• 陽性克隆測序和分析；

• 一對一驗證。

技術(shù)優(yōu)勢

• 活細(xì)胞內(nèi)檢測一對一的互作蛋白組，反應(yīng)生理狀態(tài)下的互作實景；

• 互作檢測結(jié)果直觀，肉眼可辨；

• 結(jié)果真實，可以甘油菌形式進(jìn)行互作實物保存，重復(fù)性好；

• 物種普適性高；

• 高通量篩選蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，一對一驗證提高數(shù)據(jù)可信度；

• 無需蛋白提取，不會因為提取動作，影響互作真實性。

技術(shù)缺點

• 實驗流程多，周期較長；

• 無菌操作要求高；

• 蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平與高等動植物可能存在差異。

親和純化質(zhì)譜

親和純化質(zhì)譜技術(shù)是利用多克隆抗體或表位標(biāo)記從細(xì)胞提取物中親和捕獲誘餌蛋白，并通過質(zhì)譜法確定相關(guān)的相互作用蛋白質(zhì)，最早是在酵母中應(yīng)用的，目前在人，哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用廣泛，由于植物蛋白質(zhì)表達(dá)量較低，適合植物使用的標(biāo)簽較少，純化效率低，所以在植物中的應(yīng)用比較有限。

技術(shù)流程

• 構(gòu)建融合標(biāo)簽的誘餌蛋白表達(dá)載體；

• 載體瞬時轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞或組織；

• 準(zhǔn)備細(xì)胞抽提物，可通過WB檢測表達(dá)效果；

• TAP純化互作蛋白，可設(shè)置實驗組和對照組分別酶解后，獲得2組多肽混合物；

• 質(zhì)譜鑒定互作蛋白。

技術(shù)優(yōu)勢

• 可以鑒定出在空間上非直接物理相互作用的蛋白質(zhì)（也可解讀為劣勢）；

• 得到接近生理條件下與標(biāo)記蛋白相互作用的蛋白質(zhì)；

• 可實現(xiàn)大規(guī)模自動化研究蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

技術(shù)缺點

準(zhǔn)備細(xì)胞抽提物時需保持蛋白相互作用的穩(wěn)定性，處理方式不能太劇烈，因此不太適用于膜蛋白或核蛋白的互作蛋白檢測；

• 無法確定所鑒定到的蛋白是否是與誘餌蛋白直接互作的（也可解讀為優(yōu)勢）；

• 串聯(lián)親和純化嚴(yán)格程度不同，可能會導(dǎo)致假陽性或假陰性。

（圖片來源：Protein-protein interaction networks as miners of biological discovery）

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解更多酵母文庫、酵母雙雜交、酵母雜交、多組學(xué)技術(shù)

猜你想看

1、酵母雜交Tips7 膜體系功能驗證

2、酵母雜交Tips6 順式作用元件怎么看？

3、【一些概念】關(guān)于啟動子

4、【一些概念】關(guān)于SNP

原創(chuàng)聲明：本文由歐易生物(OEBIOTECH)學(xué)術(shù)團(tuán)隊報道，本文著作權(quán)歸文章作者所有。歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)及分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載。