蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）已成為靶向不可成藥蛋白質(zhì)組的新型療法。PROTAC是異型雙功能小分子，同時(shí)與靶蛋白和泛素（Ub）E3連接酶結(jié)合。這隨后導(dǎo)致靶蛋白的泛素化和降解。

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體外泛素化試劑盒的開發(fā)是為了建立一種高通量方法，該方法可以通過監(jiān)測蛋白質(zhì)獲得泛素化的內(nèi)在能力來準(zhǔn)確預(yù)測PROTAC效率。LifeSensors為三種E3泛素連接酶提供該試劑盒：Ceeblon，VHL和HDM2，以監(jiān)測PROTAC介導(dǎo)的泛素化，以選擇靶標(biāo)。

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對于測定，PROTAC首先添加到檢測板，然后是E3連接酶和靶蛋白，以實(shí)現(xiàn)三元復(fù)合物組成作為連續(xù)步驟，然后加入含有wt泛素和ATP的E1-E2酶混合物以啟動(dòng)PROTAC介導(dǎo)的泛素化，在反應(yīng)過程中，多泛素鏈由E1-E2-E3機(jī)械產(chǎn)生的能量被識別并捕獲在井中。遵循反應(yīng)和隨后的洗滌步驟，將分離的多泛素化產(chǎn)物與針對感興趣蛋白質(zhì)的抗體（不包括）和與HRP綴合的第二抗體（包括）允許通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測。

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因此，捕獲的這種“夾心”ELISA樣測定中的多泛素化產(chǎn)物是PROTAC的定量測定活動(dòng)此外，這種檢測策略不需要額外的非本地標(biāo)記或泛素的標(biāo)記，這可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)假象。

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艾美捷PROTAC體外泛素化測定試劑盒#PA-0770-P100組件：

體外泛素化檢測板?1?個(gè)板

10X?檢測緩沖液?1.2毫升

E3?混合 （20X）?1 x 250μL

E1-E2-泛素化混合物 （20X）?1 x 250μL

二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶聯(lián)物）?60μ升 （100X）

檢測試劑?1?和?2?DR1- 1毫升和DR2- 1毫升

封閉濃縮液（5X）?5毫米

普羅塔克在二甲基亞種組織中的應(yīng)用?10微升

靶蛋白陽性對照?BRD3?（20X）?20微升

抗?BRD3?抗體 （100X）?5微升

抗小鼠HRP偶聯(lián)物（100X）?5微升

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PROTAC體外泛素化測定試劑盒的應(yīng)用：

測試PROTAC和分子膠（MGs）活性。

比較多個(gè)?PROTAC?變體，并從?UbMax?建立預(yù)測性DC 50。

選擇所有三種連接酶來比較PROTACs/MGs活性以證明選擇性。

測試?PROTAC?底物特異性和亞型選擇性。