什么是DNA測(cè)序

DNA測(cè)序是一種用于測(cè)定特定DNA分子的核苷酸序列的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。它使用熒光標(biāo)記的核苷酸，這些核苷酸在PCR過程中摻入?；跓晒鈾z測(cè)技術(shù)，有兩種主要的測(cè)序方法：Sanger測(cè)序和二代測(cè)序。

DNA測(cè)序如何工作

在DNA測(cè)序過程中，熒光標(biāo)記的核苷酸通過PCR添加到特定的DNA片段中。對(duì)于DNA鏈的伸長(zhǎng)，使用常規(guī)脫氧核苷酸（dNTP）。然而，ddNTPs被添加到反應(yīng)混合物中，該混合物是熒光標(biāo)記的。由于ddNTP在脫氧核糖分子中沒有3′OH基團(tuán)，因此可能不會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的鏈生長(zhǎng)，從而終止鏈生長(zhǎng)。DNA的糖磷酸骨架是由脫氧核糖的3′OH基團(tuán)和進(jìn)入核苷酸的磷酸基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵形成的。然而，ddNTPs以低濃度添加;因此，它們不會(huì)立即終止鏈條增長(zhǎng)。

將四種類型的ddNTP添加到四種單獨(dú)的PCR混合物中。通過添加ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP進(jìn)行四種獨(dú)立的PCR反應(yīng)。因此，在每個(gè)反應(yīng)混合物中，鏈生長(zhǎng)分別終止于A，G，C和T核苷酸。例如，在加入ddATP的反應(yīng)混合物中，不同擴(kuò)增子的生長(zhǎng)終止于DNA片段中的每個(gè)A核苷酸處。通過Sanger測(cè)序測(cè)定DNA序列如圖2所示。

四種類型的核苷酸中的每一種都用單獨(dú)的熒光顏色標(biāo)記;ddATP用綠色染料標(biāo)記;ddGTP用黃色染料標(biāo)記;ddCTP用藍(lán)色標(biāo)記;ddTTP用紅色染料標(biāo)記。因此，四個(gè)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子以不同的顏色標(biāo)記。

在擴(kuò)增感興趣的DNA片段后，通過凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增子。DNA片段的核苷酸序列可以通過檢測(cè)發(fā)射熒光來確定。通過Sanger測(cè)序，每次運(yùn)行都可以輕松確定750-1，000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)片段的核苷酸序列。然而，由于基因組中存在大量核苷酸，全基因組核苷酸序列的測(cè)定仍然具有挑戰(zhàn)性。然而，下一代測(cè)序技術(shù)如454測(cè)序，每次運(yùn)行可以讀取約2000萬個(gè)堿基對(duì)。

結(jié)論

DNA測(cè)序是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于測(cè)定DNA片段的核苷酸序列。在測(cè)序過程中，熒光標(biāo)記的核苷酸通過PCR添加到DNA片段中。通過檢測(cè)發(fā)射熒光，可以確定核苷酸序列。