膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中至關(guān)重要。近日， Paul W. Frazel和Shane A. Liddelow等團(tuán)隊(duì)利用scRNA-seq/snRNA-seq技術(shù)研究小鼠和人類細(xì)胞，鑒定潛在關(guān)鍵基因，簡化星形膠質(zhì)細(xì)胞differentiation protocols，揭示基因組調(diào)控位點(diǎn)，為未來膠質(zhì)細(xì)胞研究提供指導(dǎo)。

他們的成果發(fā)表在近期的Nature Neuroscience雜志上，名為 “Longitudinal scRNA-seq analysis in mouse and human informs optimization of rapid mouse astrocyte differentiation protocols”

通過單細(xì)胞RNA測序，作者研究了小鼠和人類星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育中間階段，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控基因。此外，它們縮短了小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分化方案，比較了不同影響因素對基因表達(dá)的影響。他們還使用多組學(xué)測序深入研究非編碼基因組區(qū)域，揭示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)（glial fate）的關(guān)鍵聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)有望促進(jìn)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

1. 體外人類星形膠質(zhì)細(xì)胞分化分析

作者使用了無血清分化方案，生成混合培養(yǎng)，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，以模仿神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一起生長的更自然環(huán)境。作者在第30天和第50天分別采集了樣本，對應(yīng)于神經(jīng)生成完成和膠質(zhì)生成開始，然后進(jìn)行了scRNA-seq分析（圖1）。結(jié)果顯示，體外分化對研究膠質(zhì)生成非常有效。通過基因表達(dá)和免疫染色，作者確認(rèn)了成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞簇（圖1）。

進(jìn)一步分析表明早期神經(jīng)/星細(xì)胞祖細(xì)胞與可能成為少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞不同。另外，作者觀察到一些細(xì)胞可能同時(shí)形成星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，代表了早期致力于膠質(zhì)形成的細(xì)胞。

最后，作者發(fā)現(xiàn)了四個(gè)穩(wěn)定的宏觀狀態(tài)，包括兩個(gè)成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞簇、神經(jīng)元和少突細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入了解膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程中的不同階段。

圖1. 人類膠質(zhì)分化的scRNA-seq揭示了譜系特異性前體和瞬態(tài)

2. 與命運(yùn)決策（fate decisions）相關(guān)的基因鑒定

為深入研究膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的中間過程，作者尋找了與特定宏觀狀態(tài)的命運(yùn)高度相關(guān)的基因（圖1h-j）。數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞類型的分化順序與大腦發(fā)育一致。神經(jīng)元分化概率隨時(shí)間下降，而星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化概率相反。高表達(dá)DCX基因的細(xì)胞更有可能成為神經(jīng)元。他們還發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元分化高度相關(guān)的基因，包括STMN2、DCX、ELAVL4和ELAVL2。

在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，TTYH1與分化概率最相關(guān)，盡管此前未與星形膠質(zhì)細(xì)胞分化有關(guān)。SPARC和SPARCL1的表達(dá)也與星形膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)高度相關(guān)。對于少突膠質(zhì)細(xì)胞，UGT8和MBP與分化概率最相關(guān)。

3. 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分化方案的優(yōu)化

作者優(yōu)化小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞的分化。最近的研究表明小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分化方案無法產(chǎn)生成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，與人類分化方案形成鮮明對比。在缺乏神經(jīng)元發(fā)育信號的情況下，星形細(xì)胞存在不成熟情況，強(qiáng)調(diào)了混合細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢，并更加強(qiáng)調(diào)了了解細(xì)胞命運(yùn)決定的必要性。

作者修改了無血清分化方案，旨在生成中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。修改包括去除CNTF生長因子、使用聚-D-賴氨酸和層粘蛋白涂抹板、去除維甲酸和平滑激動(dòng)劑（圖2）。通過刺激細(xì)胞并測量Gfap表達(dá)，他們證實(shí)了修改后的分化方案可在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生GFAP高水平的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖2.小鼠膠質(zhì)分化的scRNA-seq揭示了譜系特異性前體和瞬態(tài)

4. 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的早期階段

為深入了解早期星形細(xì)胞發(fā)育，作者采用scRNA-seq分析了前12個(gè)分化日的基因表達(dá)。RNA速度分析顯示從mESC和EB到中間階段的速度流動(dòng)（圖2d）。采用WOT算法，他們識別了神經(jīng)元宏觀狀態(tài)和非神經(jīng)元宏觀狀態(tài)（圖2e）。

此后，他們計(jì)算了進(jìn)入這兩個(gè)狀態(tài)的細(xì)胞概率，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞進(jìn)入非神經(jīng)元狀態(tài)（圖2g）。研究隨時(shí)間變化的概率對數(shù)幾率發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間推移，進(jìn)入神經(jīng)元狀態(tài)的概率下降，與神經(jīng)基因表達(dá)下降一致。Dcx是與神經(jīng)元狀態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵基因之一。最后，作者研究了在FGF1/BMP4處理下基因表達(dá)的變化。集群1表達(dá)了與星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因，包括Slc1a3和細(xì)胞周期基因，而集群0表達(dá)與TGF-β信號相關(guān)的基因。這些結(jié)果有助于深入了解早期星形細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵過程（圖3）。

圖3.分析早期小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的子集

5. 星形膠質(zhì)細(xì)胞分化方案的多組學(xué)分析

作者比較CNTF和BMP4/FGF1引起的基因表達(dá)變化。進(jìn)行了多組學(xué)分析，包括snATAC-seq和snRNA-seq。他們確定了與命運(yùn)獲取相關(guān)的基因，還比較了最終時(shí)間點(diǎn)之間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)CNTF條件的頂級標(biāo)記基因是S100a6，標(biāo)志著星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型。他們分析snATAC-seq數(shù)據(jù)（圖4），確定在一個(gè)生長因子條件下與另一個(gè)條件下富集的峰值。進(jìn)行TF基序分析，作者發(fā)現(xiàn)在CNTF條件下與Smad家族TFs相關(guān)的富集模式，與之前的研究一致。作者還檢查了CNTF的S100a6和BMP4/FGF1的Fabp7兩個(gè)位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性，發(fā)現(xiàn)存在明顯差異。

圖4. 對兩個(gè)不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)間序列的多組學(xué)分析

總結(jié)

本研究使用sc/snRNA-seq數(shù)據(jù)分析小鼠和人類膠質(zhì)細(xì)胞分化，提出了分化方案假設(shè)，為未來譜系追蹤實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了潛在的膠質(zhì)譜系前體和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41593-023-01424-2

參考文獻(xiàn)

Frazel PW, Labib D, Fisher T, et al. Longitudinal scRNA-seq analysis in mouse and human informs optimization of rapid mouse astrocyte differentiation protocols. Nat Neurosci. 2023;26(10):1726-1738. doi:10.1038/s41593-023-01424-2

編譯作者：Ayden（brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)）

校審：Simon（brainnews編輯部）






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