1??細(xì)胞準(zhǔn)備
轉(zhuǎn)染前一天，取出處于對數(shù)生長期的健康細(xì)胞，吸掉原來的培養(yǎng)液，用無菌 PBS 清洗細(xì)胞。加入 1 mL胰酶消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察所有細(xì)胞完全皺縮變圓后加入終止液終止消化。采用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打， 后上下吹打的方式。收集細(xì)胞懸液于 15 mL離心管中，每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5min。用羅氏 CASY 快速細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。 以每孔 3-5×105 細(xì)胞密度接種到 6 孔培養(yǎng)板上，在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。??具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同，掌握為轉(zhuǎn)染時使細(xì)胞達(dá)到 80%~90%的融合率。轉(zhuǎn)染前 3 h,取出無抗生素培養(yǎng)的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察。若融合率達(dá) 80%~90%，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)??
2??耗材及試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開始前，準(zhǔn)備好所需的 Optimem I 無血清培養(yǎng)基，去核酸酶 EP 管，經(jīng)高壓滅菌的200 uL和 1 mL槍頭各一盒槍頭，羅氏 X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑??
3??細(xì)胞轉(zhuǎn)染
?????首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的制備。在已標(biāo)記好的 EP 管中分別加入 100uL Optimem I 無血清培養(yǎng)基采用 1 if 質(zhì)粒:100 uLOptimemI 稀釋質(zhì)粒 DNA。槍頭輕輕吹打混勻??
將 3 μL轉(zhuǎn)染試劑緩緩加入上述稀釋好的 100 uL質(zhì)粒 DNA 中，即 X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑與 DNA 質(zhì)粒的比例是 3 uL比 1 μg。最小體積為 100μL，減少復(fù)合物體積將會 顯著降低轉(zhuǎn)染效率. 轉(zhuǎn)染試劑與 DNA 的最優(yōu)比例，以及復(fù)合物的最適總體積，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系、細(xì)胞密度、檢測時細(xì)胞生長狀況和基因表達(dá)的不同進(jìn)行調(diào)整。
在 15 至 25 度條件下，靜置轉(zhuǎn)染試劑-DNA 質(zhì)粒復(fù)合物 EP 管，15-20min。取出準(zhǔn)備好的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，做好相應(yīng)標(biāo)記，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入細(xì)胞6孔板中。輕輕搖動培養(yǎng)皿，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞充分接觸。將培養(yǎng)板放于 37 °C、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。