青光眼是不可逆致盲性眼病，其特征是進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)變性。色氨酸代謝與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerves system，CNS）的免疫和炎癥有關(guān)，芳烴受體（AhR）可響應(yīng)內(nèi)源性色氨酸代謝物發(fā)揮抗炎作用的免疫調(diào)節(jié)，但AhR及其激動(dòng)劑色氨酸代謝物在青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)變性中的作用尚不清楚。

2023年2月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院郭文毅/孫浩課題組在Cell? Death & Disease（IF 9.0）發(fā)表了題為“Aryl hydrocarbon receptor dependent anti-inflammation and neuroprotective effects of tryptophan metabolites on retinal ischemia/reperfusion injury”的研究成果，利用代謝組學(xué)技術(shù)，以青光眼患者和對(duì)照組的血清為研究對(duì)象，闡明色氨酸代謝和視網(wǎng)膜AhR信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)青光眼小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的局部炎癥中的作用機(jī)制。中科新生命為研究提供靶向代謝組學(xué)技術(shù)支持。

?研究材料

原發(fā)性開(kāi)角型青光眼（POAG）、原發(fā)性閉角型青光眼（PACG）和白內(nèi)障（非青光眼對(duì)照）患者的血清

?技術(shù)路線(xiàn)

步驟1：靶向代謝組學(xué)分析和免疫熒光染色；

步驟2：視網(wǎng)膜損傷和視網(wǎng)膜炎癥狀態(tài)檢測(cè)；

步驟3：共定位分析和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥狀態(tài)檢測(cè)；

步驟4：小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)IR視網(wǎng)膜的神經(jīng)毒性檢測(cè)；

步驟5：炎癥因子檢測(cè)及炎癥信號(hào)通路驗(yàn)證。

?研究結(jié)果

1. 青光眼患者中色氨酸代謝和AhR信號(hào)傳導(dǎo)改變

為研究色氨酸代謝是否參與青光眼的發(fā)展，對(duì)青光眼（POAG、PACG）和非青光眼對(duì)照組患者的血清進(jìn)行了靶向色氨酸代謝組學(xué)檢測(cè)，并檢測(cè)青光眼患者和小鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注（Ischemia/reperfusion，IR）模型視網(wǎng)膜AhR表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除血清素外，青光眼患者中其余色氨酸代謝物水平均較對(duì)照組下降，且在POAG中更顯著。眼球切片免疫熒光染色顯示，PACG及小鼠IR視網(wǎng)膜AhR表達(dá)量均較對(duì)照組下降（圖1）。以上結(jié)果表明，色氨酸代謝的改變和色氨酸衍生的AhR配體的減少可能導(dǎo)致青光眼中視網(wǎng)膜AhR激活不足。

2. ITE通過(guò)激活A(yù)hR減輕IR小鼠模型中的視網(wǎng)膜損傷并改善視網(wǎng)膜局部炎癥

ITE是一種由色氨酸代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性AhR激動(dòng)劑，為了驗(yàn)證AhR在視網(wǎng)膜抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。小鼠IR模型腹腔注射ITE，發(fā)現(xiàn)ITE可顯著減輕IR引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)損失以及降低視網(wǎng)膜的炎癥因子的表達(dá)水平（圖2）。接著，為研究ITE的保護(hù)作用是否依賴(lài)于AhR的激活。發(fā)現(xiàn)，ITE可顯著上調(diào)視網(wǎng)膜AhR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，添加AhR拮抗劑CH223191后，ITE的視網(wǎng)膜保護(hù)作用顯著減弱（圖3）。以上結(jié)果表明，色氨酸代謝物ITE可通過(guò)激活視網(wǎng)膜AhR發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

3. ITE 通過(guò)激活A(yù)hR抑制由LPS誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥

小膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼炎癥過(guò)程中起著重要作用，并且AhR在限制CNS炎癥中至關(guān)重要，為進(jìn)一步研究ITE作用的具體細(xì)胞和機(jī)制，對(duì)人及小鼠視網(wǎng)膜AhR和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA1的共定位情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，人及小鼠視網(wǎng)膜中AhR和IBA1均有較好的共定位，提示視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞存在AhR表達(dá)。進(jìn)一步，利用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞探索AhR活化防止IR的機(jī)制。Western和免疫熒光結(jié)果顯示，ITE處理后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)AhR顯著增加，LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α，IL-1β和iNOS的蛋白水平顯著下降。然而，添加AhR拮抗劑CH223191后，ITE的抗炎作用明顯減弱（圖4）。以上結(jié)果表明，ITE對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的抑制作用依賴(lài)于AhR。

4. ITE激活A(yù)hR以緩解小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)IR視網(wǎng)膜的神經(jīng)毒性

為探討小膠質(zhì)細(xì)胞AhR激活對(duì)視網(wǎng)膜損傷的調(diào)節(jié)作用，收集由LPS處理和ITE+LPS處理的BV2條件培養(yǎng)基，經(jīng)濃縮后通過(guò)玻璃體腔注射的方式研究小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥對(duì)小鼠視網(wǎng)膜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若無(wú)IR損傷，BV2條件培養(yǎng)基對(duì)視網(wǎng)膜無(wú)顯著影響；但在IR組中，LPS誘導(dǎo)的BV2條件培養(yǎng)基顯著加重了視網(wǎng)膜損傷，而ITE+LPS誘導(dǎo)的BV2條件培養(yǎng)基則顯著減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞的這種神經(jīng)毒性作用（圖5）。以上結(jié)果表明，色氨酸代謝物ITE可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞AhR來(lái)顯著減弱小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)IR視網(wǎng)膜的毒性作用。

5. ITE通過(guò)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的AhR活化緩解NFκB和ERK依賴(lài)性炎癥

為驗(yàn)證上述小膠質(zhì)細(xì)胞AhR的作用，并進(jìn)一步闡明小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的可能炎癥因子，采用炎癥細(xì)胞因子抗體陣列試劑盒檢測(cè)BV2-CCM中的細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，ITE預(yù)處理顯著下調(diào)多種炎癥因子的分泌，但顯著上調(diào)炎癥因子IL-10的分泌；GO分析提示可能與調(diào)控ERK通路有關(guān)（圖6）。進(jìn)一步，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ITE抑制ERK磷酸化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ITE也顯著抑制經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子NFκB的激活（圖7）。以上結(jié)果表明，ITE可能通過(guò)激活A(yù)hR抑制NFκB和ERK信號(hào)傳導(dǎo)，從而改變小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

?小結(jié)

該論文研究發(fā)現(xiàn)，青光眼患者血清色氨酸代謝紊亂以及AhR信號(hào)傳導(dǎo)在視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用。補(bǔ)充色氨酸代謝物ITE可以通過(guò)激活A(yù)hR，下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的ERK和NFκB依賴(lài)性炎癥，從而減輕IR損傷下的視網(wǎng)膜神經(jīng)毒性作用。提出了通過(guò)補(bǔ)充色氨酸代謝物對(duì)AhR信號(hào)傳導(dǎo)的內(nèi)在調(diào)節(jié)可以作為治療青光眼新途徑的可能性。

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