? ? ? ?今天介紹的是鋅指蛋白(Zinc Finger Protein)，簡稱鋅指(Zinc Finger，ZF)。

簡介

? ? ? ?鋅指(Zinc Finger)是一種小的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基序，其特征是一個或多個鋅離子(Zn2+)配合以穩(wěn)定折疊。它最初是用來描述非洲爪蛙(非洲爪蟾)轉(zhuǎn)錄因子IIIA的手指狀結(jié)構(gòu)的。然而，在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)它包含多種不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1983年，非洲爪蟾(Xenopus laevis)TFIIIA最初被證明含有鋅，并需要鋅來維持其功能，首次報道了嗜鋅基因調(diào)節(jié)蛋白，隨后不久，果蠅的Krüppel因子也出現(xiàn)了它通常作為金屬結(jié)合域出現(xiàn)在多結(jié)構(gòu)域蛋白中。

? ? ? ?含有鋅指的蛋白質(zhì)——鋅指蛋白被分為幾個不同的結(jié)構(gòu)家族。與許多其他明確定義的超二級結(jié)構(gòu)(如α螺旋或β發(fā)夾)不同，鋅指有多種類型，每一種都有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)。一個特定的鋅指蛋白的類別是由這個三維結(jié)構(gòu)決定的，但它也可以根據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)或配體的身份來識別鋅離子。然而，盡管這些蛋白質(zhì)種類繁多，但絕大多數(shù)通常作為相互作用模塊，與DNA、RNA、蛋白質(zhì)或其他小而有用的分子結(jié)合，結(jié)構(gòu)的變化主要是改變特定蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性。

? ? ? ? 自它們最初的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)的闡明以來，這些相互作用模塊已被證明在生物界普遍存在，可能存在于人類基因組的3%的基因中此外，鋅指已經(jīng)成為非常有用的各種治療和研究能力。通過基因工程使鋅指與特定序列具有親和關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)，而鋅指核酸酶和鋅指轉(zhuǎn)錄因子是目前研究的兩個重要應(yīng)用。

歷史

? ? ? ?鋅指是在Aaron Klug實(shí)驗(yàn)室對非洲爪蟾(Xenopus laevis)的轉(zhuǎn)錄研究中首次發(fā)現(xiàn)的。一項(xiàng)對特定RNA序列的轉(zhuǎn)錄研究表明，一個小轉(zhuǎn)錄因子(轉(zhuǎn)錄因子IIIA，TFIIIA)是由于鋅配位指狀結(jié)構(gòu)的存在TFIIIA的氨基酸測序顯示了30個氨基酸的9個串聯(lián)序列，包括2對半胱氨酸和組氨酸不變殘基。擴(kuò)展x射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)證實(shí)了鋅配體的同一性:兩個半胱氨酸和兩個組氨酸這些配體與鋅配合形成的DNA結(jié)合環(huán)被認(rèn)為類似于手指，因此被命名為。此后不久，Schuh團(tuán)隊于1986年在果蠅中發(fā)現(xiàn)了Krüppel因子最近在不同生物體中蛋白質(zhì)特性方面的工作揭示了鋅離子在多肽穩(wěn)定中的重要性

? ? ? ? 1991年和1993年研究的鋅指-DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)揭示了鋅指與DNA相互作用的典型模式。鋅指的結(jié)合不同于許多其他的DNA結(jié)合蛋白，它們是通過雙螺旋結(jié)構(gòu)的2倍對稱來結(jié)合DNA，而鋅指是線性串聯(lián)結(jié)合不同長度的核酸序列鋅指通常與DNA序列結(jié)合，稱為GC box鋅指基序的模塊化特性允許大量DNA和RNA序列的結(jié)合具有高度的親和性和特異性，因此非常適合用于可以靶向和結(jié)合特定DNA序列的工程蛋白。1994年，一種人工構(gòu)建的三指蛋白可以阻斷小鼠細(xì)胞系中致癌基因的表達(dá)。鋅指融合到其他各種效應(yīng)域，其中一些具有治療意義，已經(jīng)被構(gòu)建，成為一種成熟的體系。

功能域

? ? ? ? 鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc Finger, ZnF)是一種相對較小的蛋白質(zhì)基序，它包含多個指狀突起，可與靶分子串聯(lián)接觸。其中一些區(qū)域與鋅結(jié)合，但也有許多不結(jié)合，而是與鐵等其他金屬結(jié)合，或者根本不與金屬結(jié)合。例如，一些家庭成員形成鹽橋來穩(wěn)定手指狀褶皺。它們最初被識別為非洲爪蟾(Xenopus laevis)轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中的DNA結(jié)合基序，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它們可以結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)底物。它們的結(jié)合特性取決于手指結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、手指間的連接子以及手指的高階結(jié)構(gòu)和數(shù)量。ZnF域通常在簇狀結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，在簇狀結(jié)構(gòu)中手指具有不同的結(jié)合特異性。ZnF基序出現(xiàn)在幾個不相關(guān)的蛋白超家族中，其序列和結(jié)構(gòu)各不相同。它們在結(jié)合模式上顯示出相當(dāng)多的多樣性，甚至在同一類群的成員之間(例如，一些結(jié)合DNA，另一些結(jié)合蛋白質(zhì))，這表明ZnF基元是穩(wěn)定的支架，已經(jīng)進(jìn)化出專門的功能。例如，含znf的蛋白質(zhì)在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA運(yùn)輸、細(xì)胞骨架組織、上皮細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞粘附、蛋白質(zhì)折疊、染色質(zhì)重塑和鋅感知等方面發(fā)揮作用鋅結(jié)合基序是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在與靶結(jié)合時很少發(fā)生構(gòu)象變化。

分類

? ? ? ? 最初，鋅指一詞僅用于描述爪蟾DNA結(jié)合基序；然而，它現(xiàn)在被用來指任何數(shù)量的與鋅離子配位有關(guān)的結(jié)構(gòu)。一般來說，鋅指配合鋅離子與半胱氨酸和組氨酸殘基的組合。最初，這些殘基的數(shù)量和順序被用來分類不同類型的鋅指(例如，Cys2His2、Cys4和Cys6)。最近，一種更系統(tǒng)的方法被用來分類鋅指蛋白。該方法根據(jù)鋅指蛋白折疊區(qū)域主干的整體形狀，將鋅指蛋白分類為“折疊組”。鋅指最常見的“折疊組”是Cys2His2-like(“經(jīng)典鋅指”)、Treble clef和鋅綬帶蛋白(Zinc Ribbon)。

應(yīng)用

? ? ? ?多種蛋白質(zhì)工程技術(shù)可用于改變鋅指的DNA結(jié)合特異性，這種工程鋅指的串聯(lián)重復(fù)序列可用于靶向所需的基因組DNA序列將第二個蛋白結(jié)構(gòu)域(如轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子)與一組結(jié)合在給定基因啟動子附近的工程鋅指結(jié)合，可以用來改變該基因的轉(zhuǎn)錄基因工程鋅指陣列與可切割或修飾DNA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的融合也可用于將這些活性靶向到所需的基因組位點(diǎn)工程鋅指陣列最常見的應(yīng)用包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Zinc Finger Transcription Factors)和鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases)，但也有其他應(yīng)用的描述。典型的工程鋅指陣列有3到6個獨(dú)立的鋅指結(jié)構(gòu)，結(jié)合的靶位點(diǎn)長度從9個堿基對到18個堿基對不等。具有6個鋅指圖案的陣列特別有吸引力，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合的目標(biāo)位點(diǎn)足夠長，有很好的機(jī)會在哺乳動物基因組中是唯一的。

鋅指核酸酶

? ? ? ?基因工程鋅指陣列通常與DNA裂解結(jié)構(gòu)域(通常是FokI的裂解結(jié)構(gòu)域)融合，生成鋅指核酸酶。這種鋅指-FokI融合已經(jīng)成為操縱許多高等生物基因組的有用試劑，包括黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、煙草、玉米、斑馬魚、各種哺乳動物細(xì)胞和大鼠。由于非同源DNA修復(fù)途徑的易錯特性，將雙鏈斷裂定位到所需的基因組位點(diǎn)可用于將框架移位突變引入基因編碼序列。如果同源DNA“供體序列”也被使用，那么基因組位點(diǎn)可以通過同源定向修復(fù)途徑轉(zhuǎn)化為一個確定的序列。一項(xiàng)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在評估鋅指核酸酶破壞CD4+T細(xì)胞中的CCR5基因，作為一種潛在的AIDS治療方法。

如何設(shè)計

? ? ? ? DNA序列合成順序?yàn)?'→3'，蛋白質(zhì)合成順序?yàn)镹→C，而鋅指模塊錨定DNA堿基序列方向則是與DNA合成順序相反。

? ? ? ?例如：錨定序列為GGGGCCGGAGCCGCAGTG。由于每個鋅指模塊只能錨定3個連續(xù)堿基，因此將錨定序列每三個堿基分為一組：GGG/GCC/GGA/GCC/GCA/GTG。然后調(diào)整順序，得GTG/GCA/GCC/GGA/GCC/GGG。

? ? ? ? ?鋅指模塊標(biāo)準(zhǔn)格式為YKCPECGKSFSnnnnnnnHQRTH。其中，nnnnnnn為鋅指模塊的錨定決定單元。

? ? ? ?查表，得GTG=RSDELVR，GCA=QSGDLRR，GCC=DCRDLAR，GGA=QRAHLER，GCC=DCRDLAR，GGG=RSDKLVR。??

? ? ? ? ?構(gòu)建鋅指模塊：

1.YKCPECGKSFSRSDELVRHQRTH

2.YKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTH

3.YKCPECGKSFSDCRDLARHQRTH

4.YKCPECGKSFSQRAHLERHQRTH

5.YKCPECGKSFSDCRDLARHQRTH

6.YKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTH

? ? ? ? 用鋅指連接肽TGEKP，在鋅指與鋅指之間建立連接：YKCPECGKSFSRSDELVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQRAHLERHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTH。

? ? ? 在N端引入LEPGEKP，在C端引入TGKKTS：LEPGEKPYKCPECGKSFSRSDELVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQRAHLERHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGKKTS。

? ? ? ? 根據(jù)所需功能，在N端或C端加入所需的目標(biāo)蛋白。例如，在N端連接HIV整合酶，將慢病毒載體定向整合至該位點(diǎn)?；蛘咴贑端連接帶有細(xì)胞核定位信號(NLS)的綠色熒光蛋白，顯示該位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的分布。

優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

? ? ? ? 鋅指蛋白的優(yōu)點(diǎn)是，可以進(jìn)入線粒體內(nèi)標(biāo)記基因。或在C末端引入FokI核酸酶后，在線粒體內(nèi)進(jìn)行基因編輯。

? ? ? ? 鋅指蛋白的缺點(diǎn)是，只能錨定9、12、15、18這些數(shù)目的堿基，因?yàn)樗鼈兌际?的倍數(shù)。少數(shù)錨定序列脫靶概率高。此外，鋅指蛋白得設(shè)計非常復(fù)雜。