第三章

反復(fù)凍融法

將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-159℃)，然后在室溫中融化。如此反復(fù)多次，就能使細(xì)胞壁破裂。凍結(jié)-融化法破壁的機(jī)制有兩方面:一方面在冷凍過(guò)程中會(huì)促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能;另一方面，冷凍時(shí)胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。

滲透壓沖擊法

先把細(xì)胞放在高滲溶液中(例如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)的水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂，使產(chǎn)物釋放到溶液中。

1.凝聚和絮凝的區(qū)別？

①凝聚作用:是指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過(guò)程。

影響凝聚作用的主要因素:無(wú)機(jī)鹽的種類、化合價(jià)以及無(wú)機(jī)鹽的用量等

常用的凝聚劑有: Al2(SO4)3 ·18H2O、AlCI3 .6H20、FeCl3、 ZnSO4、 MgCO3等。

②絮凝作用：當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝利時(shí)，膠粒可強(qiáng)烈地吸附在絮凝劑表面的功能團(tuán)上，而且一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上,產(chǎn)生架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來(lái)，有助于過(guò)濾，這一過(guò)程稱為絮凝作用。

絮凝劑:根據(jù)所帶電性不同，可分為陰離子型、陽(yáng)離子型和非離子型三類。常用的絮凝劑:有殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物及聚丙烯酸類等。

絮凝的效果:主要受絮凝劑分子量、絮凝劑用量、pH值以及操作條件等的影響

2.生物分離工程的特點(diǎn)是什么？

答:生物分離是從生物材料、微生物的發(fā)酵液、生物反應(yīng)液或動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離并純化有關(guān)產(chǎn)品(如具有藥理活性作用的蛋白質(zhì)等)的過(guò)程,又稱為下游加工過(guò)程。 生物工程的主要特點(diǎn)是生物制品多種多樣; 常無(wú)固定操作方法可循;生物材料組成非常復(fù)雜, 分離操作步驟多,不易獲得高收率; 培養(yǎng)液(或發(fā)酵液)中所含目的物濃度很低,而雜質(zhì)含量卻很高; 分離進(jìn)程必須保護(hù)化合物的生理活性; 生物活性成分離開(kāi)生物體后,易變性、破壞。

第四章

萃?。涸谌軇┹腿≈校惶崛〉娜芤悍Q為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱稱溶質(zhì)，而用以進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑，料液與萃取劑接觸后，料液中的溶質(zhì)向萃取劑轉(zhuǎn)移的過(guò)程稱為萃取。

反萃?。菏菍⑤腿∫?與反萃取劑(含無(wú)機(jī)酸或堿的水溶液 ，有時(shí)也可以是水)相接觸，使某種被萃入有機(jī)相的溶質(zhì)轉(zhuǎn)人水相，可把這種過(guò)程看作是萃取的逆過(guò)程。反萃取后不含溶質(zhì)的有機(jī)相被稱為再生有機(jī)相，含有溶質(zhì)的水溶液被稱為反萃液。

1.單級(jí)萃取和多級(jí)錯(cuò)流萃取的區(qū)別？

單級(jí)萃取:只包括一個(gè)混合器和一個(gè)分離器。料液和溶劑先經(jīng)混和器混合，達(dá)到平衡后，用分離器分離得到萃取液和萃余液。

多級(jí)錯(cuò)流萃取:料液經(jīng)萃取后的卒余液再用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取的方法稱多級(jí)錯(cuò)流萃取。

第一級(jí)的萃余液進(jìn)入第二級(jí)作為料液，并加人新鮮萃取劑進(jìn)行萃取，第二級(jí)的萃余液再作為第三級(jí)的料液，也同樣用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取。同理還可進(jìn)行4級(jí)、5級(jí)以至n級(jí)萃取。

此法與單級(jí)萃取相比，溶劑消耗量大，而得到的萃取液平均濃度較稀，但萃取較完全。

第五章

有機(jī)溶劑沉淀：向水溶液中加一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。

晶種：向水溶液中加一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。

結(jié)晶：是指溶質(zhì)自動(dòng)從飽和溶液中析出形成新相的過(guò)程。結(jié)晶包括3個(gè)過(guò)程:形成過(guò)飽和溶液、晶核形成、晶體生長(zhǎng)。

過(guò)飽和溶液：結(jié)晶過(guò)程中，溶質(zhì)濃度超過(guò)溶解度時(shí)，該溶液稱為過(guò)飽和溶液。過(guò)飽和溶液常用的形成方法：蒸發(fā)法、溫度誘導(dǎo)法、鹽析結(jié)晶法、透析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、等電點(diǎn)法、微量擴(kuò)散法、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法、共沸蒸餾結(jié)晶。

1.什么是鹽析法？鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)？

鹽析法：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液中引人定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。

鹽析法的優(yōu)點(diǎn):經(jīng)濟(jì)、不需特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)便、安全、應(yīng)用范圍廣、較少引起變性(有時(shí)對(duì)生物分子具穩(wěn)定作用，至今仍廣泛用來(lái)回收或分離蛋白質(zhì)(酶)等生物大分子物質(zhì))。

鹽析法的主要缺點(diǎn):是沉淀物中含有大量鹽析劑，而且硫酸銨易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上。

2.晶體的質(zhì)量指什么？如何提高晶體質(zhì)量？

晶體質(zhì)量主要指晶體大小、形狀和純度三個(gè)方面

提高晶體質(zhì)量的方法:

1、改變晶體大小

? ? 當(dāng)溶液快速冷卻時(shí)，能達(dá)到較高的過(guò)飽和度而得到較細(xì)小的晶體，反之緩慢冷卻常得到較大的晶體。當(dāng)溶液的溫度升高時(shí)，結(jié)晶器銅管的晶體成核速度和生長(zhǎng)速度鈴增快，但后者的影響更顯著。

2、改變晶體形狀

? ? 同種物質(zhì)的晶體，用不同的結(jié)晶方法產(chǎn)生，雖然仍屬于同一晶系，但其外形可以完全不同。外形的變化是因?yàn)樵谝粋€(gè)方向生長(zhǎng)受阻，而在另一個(gè)方向生長(zhǎng)加速所致。

3、提高晶體純度

? ? 在結(jié)晶過(guò)程中，含許多雜質(zhì)的母液是影響產(chǎn)品純度的一個(gè)重要因素。晶體越細(xì)小，吸附雜質(zhì)越多。一股把晶體和溶劑一同放在離心機(jī)或過(guò)濾機(jī)中，攪拌后再離心或抽濾，這樣洗滌效果好。

第六章

物理吸附：當(dāng)吸附劑和吸附物之間作用力是通過(guò)分子間引力(范德華力)產(chǎn)生的吸附稱為物理吸附，這是最常見(jiàn)的一種吸附現(xiàn)象。

化學(xué)吸附：如果在吸附劑和吸附物之間有電子的轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)鍵，這種吸附稱為化學(xué)吸附。

吸附物：物質(zhì)從流體相(氣體或液體)濃縮到固體表面從而達(dá)到分離的過(guò)程稱為吸附作用，在表面上能發(fā)生吸附作用的固體微粒稱為吸附劑，而被吸附的物質(zhì)稱為吸附物。

1.大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑是什么？有哪些優(yōu)點(diǎn)？

大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑，它和大孔網(wǎng)狀離子交換樹(shù)脂具有相同的大網(wǎng)格骨架。其孔徑遠(yuǎn)大于2 ~4nm，可達(dá)到100nm甚至1000nm以上，故稱“大孔”。與大孔網(wǎng)狀離子交換樹(shù)脂相比，它不含離子交換樹(shù)脂的功能團(tuán)，僅保留了多孔的骨架，其性質(zhì)與活性炭、硅膠等吸附劑相似，稱為大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑。

優(yōu)點(diǎn):與活性炭等經(jīng)典吸附劑相比，大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑具有選擇性好、解吸容易、理化性質(zhì)穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好、可反復(fù)使用和流體吸力較小等優(yōu)點(diǎn)。特別是可按照需要，通過(guò)不同的原料和合成條件改變其孔隙大小、骨架結(jié)構(gòu)和極性，因此適用于吸附各種有機(jī)化合物。

2.吸附法的定義，特點(diǎn)？

吸附法:指利用吸附作用，將樣品中的生物物活性物質(zhì)或雜質(zhì)吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑?duì)活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附能力的差異，使目的物和其他物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。

吸附法的特點(diǎn):

(1)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉、安全。

(2)少用或不用有機(jī)溶劑，吸附與洗脫過(guò)程中pH變化小，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活。

(3)天然吸附劑(特別是無(wú)機(jī)吸附劑)的吸附性能和吸附條件較難控制，吸附選擇性差，收率不高，難以連續(xù)操作。但是隨著人工合成的高聚物吸附劑的發(fā)展，其性能已有很一大改進(jìn)。

第七章

分離度：分離度又稱分辨率，為了判斷分離物質(zhì)對(duì)色譜桂在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為柱的總分離效能指標(biāo)。分離度表示相鄰兩峰的分離程度。用R表示，R越大，表明相鄰兩組分分離越好。

脫鹽：將蛋白質(zhì)與其他小分子鹽類分開(kāi)，常用方法有：凝膠層析法、包埋法、直接投入法。

1.凝膠層析的原理與特點(diǎn)？

原理：凝膠層析的分離過(guò)程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進(jìn)行的，一個(gè) 填料的顆粒含有許多不同大小的孔，這些孔對(duì)于溶劑分子來(lái)說(shuō)是很大的，它們可以自由地?cái)U(kuò)散出入。如果對(duì)溶質(zhì)分子大小合適的話，則可以不同程度地往孔中擴(kuò)散，大個(gè)的溶質(zhì)分子只能占有比較少的孔，而小個(gè)的溶質(zhì)分子則除去能占有大孔外還可以占有另外一些較小的孔。所以溶質(zhì)分子尺寸的減小可以占有的孔體積迅速增加。當(dāng)具有一 定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過(guò)時(shí)，較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長(zhǎng)，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開(kāi)，最先淋出的是最大的分子。

特點(diǎn)：

(1)凝膠層析操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。

(2)分離效果較好，再?gòu)?fù)性高。

(3)分離條件緩和。

(4)應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化

(5分辨率不高，分離操作較慢。

2.凝膠層析的操作？每步操作中的關(guān)鍵點(diǎn)？

①樣品與加樣

關(guān)鍵點(diǎn)：樣品上柱?

理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的矩形色譜帶。為了做到這一點(diǎn)，應(yīng)盡量減少加樣品時(shí)樣品的稀釋以及樣品的非平流流經(jīng)層析凝膠床體。加樣時(shí)應(yīng)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)?？梢灾苯訉悠芳拥綄游龃脖砻婊蚶脙煞N液體比重不同而分層的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)。

②洗脫與收集

關(guān)鍵點(diǎn)：洗脫劑的流速

洗脫劑的流速對(duì)分離效果有很大影響，流速不宜過(guò)快且要穩(wěn)定。

③凝膠柱的再生

關(guān)鍵點(diǎn)：反沖

對(duì)流速下降的板結(jié)凝膠柱，最簡(jiǎn)單的處理法是反沖，適當(dāng)?shù)姆礇_后往往可以恢復(fù)原來(lái)的流速。

第八章

離子交換法：是利用溶液中各種帶電離子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作方法。

大孔型離子交換樹(shù)脂：又稱大網(wǎng)格離子交換樹(shù)脂，具有大孔結(jié)構(gòu)并帶有功能基團(tuán)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶不熔聚合物，具有良好的耐磨強(qiáng)度和耐氧化、抗有機(jī)物污染的性能，用于分離、提純等。

1.離子交換樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)？離子交換樹(shù)脂的基本要求？

離子交換樹(shù)脂由三部分構(gòu)成：①惰性的不溶性的高分子固定骨架，又稱載體

②與載體以共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)的不能移動(dòng)的活性基團(tuán)，又稱功能基團(tuán)③與功能基團(tuán)以離子鍵聯(lián)結(jié)的可移動(dòng)的活性離子，亦稱平衡離子。

基本要求：

①有盡可能大的交換容量

②有良好的交換選擇性

③化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

④化學(xué)動(dòng)力學(xué)性能好

⑤物理性能好

第九章

生物親和作用：生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等活性物質(zhì)，具有識(shí)別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力，這種識(shí)別并結(jié)合的能力具有排他性，生物分子間的這種特異性相互作用稱為生物親和作用。

親和層析：是利用生物體中多數(shù)大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的分離純化技術(shù)。

金屬離子親和層析:是利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。

親和配基：是對(duì)生物分子具有專一性識(shí)別或特定的相互作用的物質(zhì)。

1.親和層析的原理？親和層析對(duì)載體的要求？

原理：生物高分子與配基的可逆結(jié)合。

對(duì)載體的要求：①載體必須能充分功能化，載體要具有足夠數(shù)量的功能基團(tuán)，或能方便地引入多個(gè)化學(xué)活性基因，以供與配基進(jìn)行共價(jià)連接之用。

②載體必須有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，盡量減少非專一性吸附。

③載體必須具有高度的水不溶性和親水性。同時(shí)，親水性還有助于親和對(duì)達(dá)到親和平衡，并減少因疏水相互作用造成的非特異性吸附。

④載體應(yīng)具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過(guò)。

⑤理想的親和層析載體外觀上應(yīng)為大小均勻的剛性小球，這樣在層析柱中才能保持良好的疏通。

第十章

相對(duì)離心力：離心力與重力的比值表示離心機(jī)的離心能力，即相對(duì)離心力（RCF）沉降速度：在離心力的作用下，物質(zhì)粒子于單位時(shí)間內(nèi)沿離心力方向移動(dòng)的距離沉降系數(shù)：系指在單位離心力場(chǎng)中，顆粒的沉降速度

速度區(qū)帶離心法：又叫速率區(qū)帶離心法。離心操作時(shí)將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線性或非線性密度梯度液上，控制離心時(shí)間，使所需組分穿過(guò)部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達(dá)到其等密度區(qū)之前即停止離心。

1.等密度區(qū)帶離心法的原理，及特點(diǎn)？

原理：在離心力作用下，不同密度的多組分顆粒在梯度介質(zhì)中“向上”或“向下”移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至其密度與介質(zhì)密度相等的位置便不再移動(dòng)，形成靜止區(qū)帶，即“達(dá)到”離心平衡。區(qū)帶的位置即該組分的“等密度點(diǎn)”。

特點(diǎn)：①加樣位置不拘。

②離心平衡后，區(qū)帶的位置、形狀、不受離心時(shí)間影響。

③梯度的密度范圍應(yīng)包括樣品中所有組分顆粒之密度。

④分離依據(jù)是顆粒組分間“浮力密度”的差異，與顆粒大小，形狀無(wú)關(guān)。

⑤離心力大小，組分顆粒的大小和形狀，介質(zhì)密度梯度的斜率和形狀，黏度影響離心時(shí)間和分辨率(區(qū)帶寬度)。

第十一章

膜分離技術(shù)：是指用膜作為選擇障礙層，允許某些組分透過(guò)而保留混合物中其他成分，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。

透析：是通過(guò)小分子經(jīng)過(guò)半透膜擴(kuò)散到水(或緩沖液)的原理，將小分子與生物大分子分開(kāi)的一種分離純化技術(shù)。

蛋白質(zhì)復(fù)性：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性程度不重時(shí),可在消除變性因素條件下使蛋白質(zhì)恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能,稱為復(fù)性。

計(jì)算題，潔霉素在20℃和pH 10.0時(shí)表觀分配系數(shù)（丁醇/水）為18。用等量的丁醇萃取料液中的潔霉素，計(jì)算理論收率？若改用1/3體積丁醇萃取，計(jì)算理論收率？

①用等量的丁醇萃取料液中的潔霉素，理論收率：

萃余率：φ=萃余液中溶質(zhì)總量/原始料液中溶質(zhì)總量×100％=1/（E+1）×100％

理論收率：1-φ=E/E+1×100％=18/18+1×100％=94.7％

②改用1/3體積丁醇萃取，理論收率：

萃取相E=18×（1/3）/1=6

理論收率：1-φ=6/6+1×100％=85.7％

選擇題：