Western Blot（WB）又稱蛋白質(zhì)免疫印跡法，是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色技術(shù)檢測目的蛋白的技術(shù)。該技術(shù)主要應用于以下場景：(1)檢測目標蛋白；(2)定量或定性地確定細胞或組織中蛋白質(zhì)的表達；(3)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-RNA相互作用的后續(xù)分析。實驗步驟多，關(guān)鍵點多，耗時長，每一步都可能影響實驗最終結(jié)果，小編今天主要為大家介紹WB底物顯色方法的選擇。

底物顯色是WB實驗的最后一步，也是實驗成敗關(guān)鍵的一步。顯色標記方法包括生物素標記、地高辛標記、各種酶標記等，酶標的底物有豐富的選擇，顯色方法也多種多樣。其中主流的顯色方法為酶促反應，該方法相較生物素反應更快也更安全。

酶促反應根據(jù)不同底物顯色方法又分為化學發(fā)光和底物顯色?；瘜W發(fā)光法靈敏度高，可達pg級；底物顯色操作簡單且成本低。目前最為人熟知的底物顯色有HRP（辣根過氧化物酶，Horseradish Peroxidase）和AP（堿性磷酸酶，Alkaline Phosphatase）兩種。

01?HRP
生色底物

HRP因比活高、分子量小、特異性強、穩(wěn)定性好和底物范圍廣等優(yōu)點成為最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶。HRP底物主要包括化學發(fā)光底物和生色底物。底物的選擇需優(yōu)先考慮靈敏度、背景及使用的方便性和穩(wěn)定性，生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等，其顯色主要是在HRP和H2O2存在下失去電子并呈現(xiàn)顏色變化積累的WB檢測結(jié)果。

上表對這4種生色底物從不同方面進行比較。

DAB作為最熟悉的底物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時會褪色，不能永久保存，而且有毒。

4-CN反差大易于拍攝對比度大的照片，可與DAB配合使用。

TMB信噪比高，成分安全，特別合適于對靈敏度要求高的WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相應的延長密封時間和洗滌次數(shù)。

AEC在各方面與DAB相似，但靈敏度較低。

化學發(fā)光底物

最常用的化學發(fā)光襯底是魯米諾（Luminol）。化學發(fā)光法與生色反應不同，它只在酶和底物同時存在的情況下發(fā)光，因此特別適合在同一膜上對不同的靶蛋白進行多重檢測。目前最高檢測靈敏度已達到Femto水平，已成為最安全、最靈敏的WB檢測方法。在許多研究者的心目中，ECL幾乎已經(jīng)成為化學發(fā)光的代名詞，一般含有Luminol、H2O2和發(fā)光增強劑等物質(zhì)。發(fā)光試劑中的Luminol被HRP和H2O2氧化產(chǎn)生熒光，熒光被發(fā)光增強劑增強。

化學發(fā)光常見的問題是抗體的濃度過高，所以抗體的量要比規(guī)定的稀釋量加大，以保證底物不會因為HRP過量而過快用完，導致結(jié)果不穩(wěn)定。

02 AP

作為一種經(jīng)典且常用的顯色交聯(lián)酶，AP的底物明顯更穩(wěn)定，而且在封閉良好的情況下，其顯色靈敏度也達低pg水平。

上表列舉了常用的AP顯色方法比較，包括BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽）、NBT（四唑硝基藍）和INT（硝基四紫唑），以及它們之間的組合使用。其中，BCIP/NBT是堿性磷酸酶的最佳底物組合之一，具有靈敏度最高、顯色銳利、成像性能好等特點，是最常用的底物組合。

各種制色方法都有其優(yōu)缺點和適用范圍，以上這些介紹讓大家把各種產(chǎn)品的優(yōu)缺點都看得淋漓盡致，希望這些內(nèi)容能給大家?guī)韼椭?，早日成為WB高手。

當然也提醒大家，操作時注意戴手套，有些顯色試劑是有毒的，避免與皮膚直接接觸，使用后記得及時徹底沖洗。