實(shí)驗(yàn)概要

免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

實(shí)驗(yàn)步驟

ICC 實(shí)驗(yàn)流程通常包括細(xì)胞培養(yǎng)與固定、通透處理、封閉、一抗孵育、二抗孵育和封片觀察。

1. 固定（1) 冷甲醇、丙酮固定樣品 1-10 分鐘，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室溫固定 15 分鐘。（2) 冷 PBS 沖洗樣品?3次。
2. 通透（膜蛋白不需要進(jìn)行此步驟，省略）（1)?將樣品在含 0.25% Triton X-100 (或 100 μM 洋地黃皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10 分鐘。Triton X-100 是最常用的去污劑，能增強(qiáng)抗體的穿透力。因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)胞膜有損壞作用，因此不適用于與細(xì)胞膜結(jié)合的抗原。（2）確定每種目標(biāo)蛋白的?Triton X-100 最佳比例。（3）PBS 沖洗細(xì)胞 3次，每次5 分鐘。

3. 封閉及孵育（1）用?1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細(xì)胞 30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來(lái)源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）。（2）細(xì)胞與抗體（含 1% BSA 的 PBST 稀釋?zhuān)┰跐窈兄泄餐跤?，室?1 小時(shí)，或 4 °C 過(guò)夜。（3) 棄去液體，PBS 沖洗細(xì)胞 3次，每次5 分鐘。（4) 細(xì)胞與二抗在 1% BSA 中孵育，室溫 1 小時(shí)，避光。（5) 棄去二抗溶液，PBS 沖洗細(xì)胞 3次，每次5 分鐘，避光。
4. 復(fù)染（1) 0.1-1 μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色劑）孵育細(xì)胞?5?分鐘。（2) PBS 沖洗。
5. 封固（1) 向蓋玻片上滴加一滴封固液封固。（2) 用指甲油密封蓋玻片防止變干并移至顯微鏡下觀察。（3) -20 °C 或 4 °C 避光保存。

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