生物具有維持生態(tài)系統(tǒng)平衡、多樣性的重要功能，常用的微生物組測序手段主要是16S/ITS/18S擴增子測序和宏基因組測序。微生物組測序在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境治理、生物能源等各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，因此涉及的樣本種類繁多，不同類型樣本的收集方法也各不相同。規(guī)范的收集方法以及充足的樣本量是保證實驗成功的第一步，因此如何正確收集和運輸保存微生物樣本就變得尤為重要。這里小編為大家整理歸納了微生物常見樣本類型的收集流程，以供大家查閱參考！

一、DNA核酸送樣建議

二、生物類樣本取樣方法

（一）不同類型樣本建議送樣量

（二）同類型樣本收集流程

1、口腔

（1）口腔拭子

將拭子伸入口腔，使拭子頭充分接觸口腔內(nèi)壁、上下牙床處粘膜、腭扁桃體、舌背面等處反復(fù)擦拭幾次，收集粘膜細胞。擦拭后將拭子裝回采集管（可內(nèi)含生理鹽水或者PBS緩沖液），做好標記后于-80℃儲存。

（2）唾液

用舌尖抵住上顎或下顎齒根以富集唾液，向采集管中輕輕吐入唾液，直至液體唾液（非氣泡）達到2 mL以上。將唾液4℃20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲存。

（3）牙菌斑

用棉卷隔濕所采集的牙齒，用無菌生理鹽水沖洗牙面后用拭子、無菌挖匙或探針采集窩溝菌斑或唇頰面菌斑；或以牙線置于兩鄰牙之間，緊貼牙面采集鄰面菌斑。樣品放入采集管內(nèi)于-80℃儲存，注意要丟棄有出血的樣品。

注意事項：

a. 取樣前需了解測試者的口腔病史，并采集相應(yīng)信息。

b. 取樣前3個月內(nèi)沒有使用過抗生素，若有，請注明使用時間及種類。因為抗生素對人體菌群影響較大。

c. 取樣當天身體無特殊不適癥狀。

d. 采樣前30 min，禁食物、禁煙酒；采樣時充分洗漱口腔。

2、腸道

（1）腸道內(nèi)容物

將實驗對象死亡處理后，無菌或較清潔環(huán)境下取出整個腸道，選取所需腸段用無菌手術(shù)刀等無菌器材采集腸道內(nèi)容物。根據(jù)動物大小不同，取適量的腸道內(nèi)容物。若不能立即進行提取，將內(nèi)容物進行液氮速凍后儲存于-80℃。

（2）腸道組織

將實驗對象死亡處理后，無菌或較清潔環(huán)境下取出整個腸道，選取所需腸段置于4℃預(yù)冷Hank's液，剔除腸系膜，腸腔剪為長約3 cm小段，縱向剖開腸管，用預(yù)冷Hank's輕輕漂洗3遍，將組織進行液氮速凍后儲存于-80℃。

（3）糞便

取新鮮糞便中段里部，單個個體的糞便用滅菌離心管稱取樣本。若不足，則根據(jù)課題需求，可將多個個體糞便樣本混合為一個樣品；如樣本珍貴，需進行備份。采集后將糞便進行液氮速凍后儲存于-80℃。

3、皮膚表面

用生理鹽水浸濕的無菌棉簽/拭子擦拭取樣部位表面，用力使其彎曲與擦拭表面成45度，平穩(wěn)而緩慢地擦拭取樣表面，之后翻轉(zhuǎn)棉簽/拭子與前次擦拭移動方向垂直擦拭取樣。取樣完成后，將每個取樣點的棉簽/拭子頭放入同一支樣品收集管中，塞子塞緊密封儲存于-80℃。建議取樣時進行多管備份保存。

注意事項：

a. 取樣前7天不能使用抗菌成分的沐浴用品。

b. 取樣前24 h不能洗澡，不能使用潤膚乳及抗菌活性的肥皂等。

c. 由于皮膚微生物采集比較困難，菌量可能不多，因此建議取樣時進行多管備份保存，以備后續(xù)實驗需求。

4、瘤胃液

（1）非胃瘺管動物

用開口器張開口器，將胃管接入吸引器，胃內(nèi)容物可自行逆流至采樣玻璃瓶中。用四層紗布過濾胃內(nèi)容物（> 100 mL），濾液4℃ 20000 rcf高速離心10 min，取沉淀用少量生理鹽水溶解后于-80℃儲存。

注意事項：

不建議在動物反芻時，用手由口腔掏出食團，榨取瘤胃液。

（2）胃瘺管動物

通過瘺管實時進行瘤胃內(nèi)容物取樣操作。

三、環(huán)境類樣本取樣方法

（一）不同類型樣本建議送樣量

（二）不同類型樣本收集流程

1、土壤

（1）土體土壤

取5-10 cm處土壤，多點采取重量相當?shù)耐寥肋M行混勻，去除雜質(zhì)后分裝到無菌離心管里，每管2-10 g，儲存于-80℃。

（2）根際土壤

去除根部大塊土壤，輕輕抖動植株去除附著不緊密的土壤，使用無菌毛刷等收集根部緊密附著土壤于無菌離心管中，每管3-5 g，儲存于-80℃。

注意事項：

a. 選擇具有代表性的土壤，隨機多點取樣等量混勻。

b. 所有工具及其他物品均需滅菌，或用采取的土壤擦拭。

c. 采集植株細根（具有吸收作用）部分的根際土。

d. 采集的土壤可用20目的篩子過篩，去除植物根、動物殘骸以及其他雜質(zhì)后分裝到無菌離心管里。

e. 為防止交叉污染，不建議使用自封袋取樣。

2、植物組織/內(nèi)生菌

新鮮植物組織依次用70%無水乙醇浸泡40 s，再用2.5%次氯酸鈉浸泡10 min（每100 mL 2.5%次氯酸鈉加一滴吐溫80），之后用無菌水清洗2-3次，將組織進行液氮速凍后儲存于-80℃。

3、植物根、葉片表面

將植物根或葉片置于50 mL無菌離心管中，加入PBS緩沖液（1x PBS，pH7.4）后漩渦振蕩，使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液中。緩沖液4℃ 20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲存?；蛘邔⒕彌_液用0.22 μm孔徑濾膜過濾，濾膜裝入離心管中于-80℃儲存。

4、水體

根據(jù)研究目的確定水體的取樣深度和范圍，采樣后選擇合適孔徑的濾膜，使用水體抽濾機抽濾適當體積水體，或抽濾至濾膜上可見明顯覆蓋物，濾膜裝入離心管中于-80℃儲存。

濾膜孔徑大小選擇參考：細菌0.22 μm；超微浮游生物Piconanoplankton 0.8-5 μm；微型浮游微生物Nanoplankton 5-20 μm；小型浮游生物Microplankton 20-180 μm；中型浮游生物Mesoplankton 180-2000 μm。

取樣體積選擇參考：海水樣本（深度密集型采樣）20 L；海水樣本（大水體量取樣）200-1700 L；河水樣本35 L；地下水1 L。

抽濾體積參考：擴增子項目：3-5 L水體過濾到1-2張濾膜（0.22 μm或0.45 μm孔徑）；宏基因組項目：30-50 L水體過濾到1-2張濾膜（0.22 μm或0.45 μm孔徑）。

注意事項：

a. 澄清水體或略渾濁水體，根據(jù)需要用0.22 μm或0.45 μm孔徑的濾膜過濾，取樣體積大于5 L。

b. 渾濁水體，建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍，再用小孔徑的濾膜過濾。

5、活性污泥

從實驗裝置中取活性污泥樣本（大于20 mL）于無菌離心管中，儲存于-80℃。

注意事項：

因活性污泥樣本體積較大，一方面儲存不便，另一方面含水量高，凍融提取也比較困難，加大了實驗工作量及難度，因此建議及時提取后保存DNA即可。

6、空氣

用不同孔徑大小的無菌濾膜篩選目的空氣微顆粒，將含顆粒的濾膜裝入無菌鋁箔或離心管內(nèi)，密封在-80℃儲存。

可進一步處理：截取適量大小濾膜，置于含有PBS緩沖液（1x PBS，pH7.4）的50 mL離心管，4℃加速度離心2 h。之后溫和旋渦處理，用0.22μm孔徑的濾膜過濾重懸液，濾膜裝入離心管中（多管備份），-80℃保存。

7、酒醅、酒糟

不破壞窯池整體密封環(huán)境條件下，使用取樣器通過取樣口直接插入酒醅進行取樣。采集不同空間位置的酒醅、酒糟（表面層、上層、中層、下層），每層取三點或多點樣本進行混勻，分裝到無菌離心管里（多管備份），-80℃儲存。

四、菌液/菌絲樣本收集流程

1、取樣容器：1.5-5 mL離心管

2、建議送樣量：細菌/真菌重測序、細菌/真菌框架圖菌體干重≥100 mg；細菌完成圖、真菌精細圖菌體干重≥300 mg

細菌/真菌菌液：取對數(shù)生長期菌液50 mL，4℃ 4000-8000 g離心10 min后棄上清，菌體沉淀用無菌水清洗2次后，收集菌體到無菌離心管中，立即用液氮速凍，儲存于-80℃。

真菌菌絲：將菌絲刮入無菌離心管中后送樣（不接受平板樣品，注意不要刮到培養(yǎng)基），立即用液氮速凍，儲存于-80℃。

五、樣品收集、儲存、寄送基本原則

（1）嚴格無菌操作：樣品采集所用工具、收集管均需滿足無菌條件，取樣環(huán)境如不能滿足無菌條件也應(yīng)盡量清潔；

（2）取樣時盡量避免樣本受到干擾，盡量縮短保存和運輸時間，以保證樣品原始狀態(tài)的微生物群落組成狀態(tài)；

（3）樣品收集管密封嚴實（封口處用封口膜封好）后儲存于-80℃；

（4）送樣優(yōu)先選擇新鮮采集的樣本，其次才是凍存樣本；

（5）用于DNA樣品制備實驗的樣品前處理或切割分裝過程盡可能在冰上快速進行，避免因時間過長導(dǎo)致樣品降解；

（6）樣品凍存期間，避免反復(fù)凍融；

（7）寄送時用大體積干冰運輸，且要保證在收到樣品開箱檢驗時有足夠的干冰剩余；

（8）樣品標記清晰且與樣品信息單一致，管蓋管身均需寫上標記，自封袋建議在兩個及以上的不同位置都寫上標記。

以上就是小編精心梳理的微生物常見樣本類型的收集流程及注意事項啦！合格的樣本是準確獲取樣本微生物組數(shù)據(jù)和項目順利完成的基礎(chǔ)，因此規(guī)范的取樣及送樣真的很重要。我們接收樣本后，如果發(fā)現(xiàn)任何異常，也會及時跟老師溝通并反饋樣本情況。如果您對于微生物組學(xué)送樣方面還有疑惑，請與小編聯(lián)系，歡迎各位老師前來咨詢！