寫在前面

????????今天推薦的是由范德比爾特大學(xué)細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系在2019年7月23日發(fā)表于Cell reports（2020IF：9.423，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Jason A. MacGurn教授，研究表明USP9X使DVL2去泛素化，以調(diào)節(jié)WNT途徑的規(guī)范。

研究背景

????????WNT信號網(wǎng)絡(luò)由多個(gè)受體組成，這些受體通過不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞各種輸入信號，以執(zhí)行多種復(fù)雜和特定環(huán)境的輸出過程。WNT信號網(wǎng)絡(luò)的完整性依賴于典型和非典型途徑之間的適當(dāng)規(guī)范，鑒于幾種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件在途徑之間是共享的，這就對該信號網(wǎng)絡(luò)的剖析提出了挑戰(zhàn)。

摘要部分

????????在此，作者報(bào)告了USP9X（一種去泛素化酶）和WWP1（一種E3泛素連接酶）調(diào)節(jié)DVL2（一種WNT信號蛋白）上的泛素化。作者的研究結(jié)果表明，USP9X介導(dǎo)的DVL2的去泛素化是典型的WNT激活所必需的，而DVL2泛素化的增加與定位到富含肌動蛋白的突起和平面細(xì)胞極性（PCP）途徑的激活有關(guān)。作者提出，WWP1-USP9X軸調(diào)節(jié)DVL2上的泛素控制器，其參與規(guī)范經(jīng)典WNT或WNT PCP途徑。這些發(fā)現(xiàn)對人類癌癥中USP9X的治療目標(biāo)有重要意義。

研究內(nèi)容

1.WWP1的WWD域協(xié)調(diào)與USP9X和DVL2的相互作用? ? ?

????????為了確定調(diào)節(jié)WWP1功能的因素，作者使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記與定量蛋白質(zhì)組學(xué)在 MDA-MB-231 細(xì)胞中生成WWP1相互作用譜。為了驗(yàn)證定量蛋白質(zhì)組學(xué)獲得的結(jié)果，作者通過免疫共沉淀證實(shí)了 FLAG-WWP1與幾個(gè)假定的相互作用物（包括USP9X、DVL2 和 SPG20）的相互作用。作者還進(jìn)行了WWP1的內(nèi)源免共疫沉淀，并在內(nèi)源性表達(dá)水平上確定了與USP9X和 DVL2 的相互作用。值得注意的是，USP9X和 DVL2 都包含多個(gè) PY基序，能夠結(jié)合NEDD4家族E3泛素連接酶的WW結(jié)構(gòu)域。

????????作者設(shè)想WWP1的WW結(jié)構(gòu)域可能起到將這些蛋白質(zhì)支架成復(fù)合物的作用。為了測試這一點(diǎn)，作者生成了WWP1WW域點(diǎn)突變變體。盡管單個(gè)WW域?qū)τ谂c DVL2 和USP9X的相互作用并非必須，但作者發(fā)現(xiàn)具有點(diǎn)突變的WWP1變體破壞了每個(gè)WW域（wwp1-4ww）與USP9X的相互作用，同時(shí)與DVL2的相互作用完全喪失。

研究結(jié)論：WWP1與MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中的USP9X和DVL2相互作用。

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2.USP9X和DVL2中的PY基序促進(jìn)了與WWP1的相互作用? ? ?

????????基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者設(shè)想SP9X和DVL2中的PY基序是參與WWP1所必需的。為了測試DVL2的兩個(gè)PY 基序是否是DVL2結(jié)合WWP1所必需的，作者構(gòu)建了DVL2變體，在各個(gè)PY 基序上發(fā)生了點(diǎn)突變，并使用FLAG-DVL2進(jìn)行共同免疫沉淀分析。該分析顯示， PY2（PPPY568）是與WWP1相互作用所必須的，而PY1（FPAY393）沒有作用。此外，這些結(jié)果表明，DVL2-WWP1的相互作用并不影響DVL2與USP9X的接合。? ? ?

????????作者假設(shè)，USP9X中的PY 基序也有助于它與WWP1的相互作用。作者構(gòu)建了一個(gè)USP9X變體，刪除了該蛋白的C端部分。刪除兩個(gè)C-端PY 基序?qū)е峦耆ヅcWWP1的相互作用。值得注意的是，USP9X與WWP1相互作用的喪失并不影響其與DVL2的相互作用，表明USP9X與DVL2的相互作用是獨(dú)立于WWP1發(fā)生的。

研究結(jié)論：DVL2-WWP1的相互作用是由DVL2的PY2結(jié)構(gòu)與WWP1的WW1或WW3結(jié)構(gòu)結(jié)合決定的。

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3.WWP1和USP9X在DVL2上建立了一個(gè)泛素流變體

????????WWP1還沒有報(bào)道過調(diào)節(jié)DVL2。鑒于WWP1和DVL2之間的物理相互作用，作者認(rèn)為DVL2可能受到WWP1的E3活性的泛素共軛。作者發(fā)現(xiàn)，重組WWP1對血凝素（HA）標(biāo)記的DVL2表現(xiàn)出泛素連接活性，而且這種活性在DVL2的賴氨酸缺陷變體中消失。重要的是，作者還發(fā)現(xiàn)USP9X可以逆轉(zhuǎn)WWP1對DVL2的泛素化作用，表明DVL2是WWP1和USP9X的底物。作者接下來假定WWP1的E3泛素連接酶活性和USP9X的去泛素化酶活性的協(xié)調(diào)可能有助于在DVL2上建立一個(gè)泛素控制器。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者將DVL2與WWP1和USP9X孵育，作者發(fā)現(xiàn)WWP1和USP9X的不同摩爾比影響了DVL2上泛素化的程度。

研究結(jié)論：WWP1和USP9X的協(xié)調(diào)運(yùn)作可以在DVL2上建立一個(gè)泛素控制器。

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4.USP9X促進(jìn)經(jīng)典WNT的激活? ???

????????作者隨后探究USP9X是否調(diào)節(jié)WNT信號。通過TopFLASH報(bào)告試驗(yàn)和b-catenin穩(wěn)定化測量，usp9x被敲低或敲除會減弱WNT的激活。在usp9x敲除的細(xì)胞中觀察到的WNT信號缺陷被野生型FLAG-USP9X的瞬時(shí)表達(dá)所回補(bǔ)，而不是其無催化活性的變體，表明USP9X的催化活性對典型的WNT激活是必需的。此外，作者發(fā)現(xiàn)用WP1130（一種已知可抑制USP9X去泛素化酶活性的小分子）處理細(xì)胞，可抑制WNT3a對典型WNT的激活。這一結(jié)果表明經(jīng)典WNT激活需要USP9X。

????????為了進(jìn)一步探討USP9X活性促進(jìn)WNT激活的可能性，作者瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了FLAG-USP9X的表達(dá)載體，并測量了WNT3a刺激下的WNT激活情況。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)野生型FLAG-USP9X的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致典型WNT途徑的激活增加。作者推測，在沒有USP9X的情況下，典型WNT激活的喪失可能是由于WWP1或其他NEDD4家族E3泛素連接酶的活性未被控制。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)在usp9x敲除的細(xì)胞中，WWP1或NEDD4L的協(xié)調(diào)敲除抑制了典型WNT激活的喪失，這表明多個(gè)NEDD4家族成員的過度激活，包括NEDD4L和WWP1，可能在沒有USP9X的情況下減弱WNT信號。另一方面作者發(fā)現(xiàn)WWP1拮抗典型WNT激活的能力與它結(jié)合DVL2的能力相關(guān)。

研究結(jié)論：USP9X促進(jìn)典型WNT的激活，而WWP1則拮抗典型WNT的激活。

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5.USP9X對WNT的調(diào)節(jié)需要DVL2去泛素化? ? ?

????????為了解決USP9X調(diào)節(jié)典型WNT的機(jī)制，作者首先測試了USP9X是否需要通過LiCl--一種GSK3的抑制劑來穩(wěn)定b-catenin。重要的是，LiCl介導(dǎo)的穩(wěn)定不需要USP9X，表明USP9X在b-catenin破壞復(fù)合物的上游發(fā)揮作用。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)敲低或敲除USP9X會導(dǎo)致DVL2蛋白的穩(wěn)態(tài)豐度下降，而且SDS-PAGE的移動性變化與超泛素化一致。? ? ?

????????作者隨后對從MDA-MB-231細(xì)胞和USP9X敲除的FLAG-DVL2親和純化物進(jìn)行了SILAC-質(zhì)譜分析（MS）。通過分析來自DVL2的多磷酸化肽和泛素殘余（diGly）肽，發(fā)現(xiàn)在沒有USP9X的情況下，四個(gè)內(nèi)部賴氨酸表現(xiàn)出泛素化的升高。為了測試USP9X介導(dǎo)的WNT信號調(diào)節(jié)是否需要DVL2泛素化，作者表達(dá)了DVL2與UL36 DUB結(jié)構(gòu)域融合，發(fā)現(xiàn)在沒有USP9X的情況下抑制了WNT的激活缺陷。

????????作者接下來探究USP9X可能調(diào)節(jié)DVL2上的多個(gè)泛素化事件的可能性。作者發(fā)現(xiàn)表達(dá)一個(gè) "無賴氨酸 "的DVL2變體，將所有編碼的賴氨酸殘基換成精氨酸（DVL2-K0），足以在沒有USP9X的情況下恢復(fù)WNT的激活。

研究結(jié)論：USP9X介導(dǎo)的DVL2的去泛素化對于激活經(jīng)典的WNT信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。

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6.DVL2的泛素化狀態(tài)調(diào)控著與經(jīng)典WNT和WNT-PCP因子的相互作用

????????作者推測，在沒有USP9X的情況下，DVL2泛素化狀態(tài)的改變會調(diào)節(jié)其作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先用SILAC-MS分析了MDA-MB-231細(xì)胞中DVL2的相互作用網(wǎng)絡(luò)。一些相互作用通過共同免疫沉淀和免疫熒光顯微鏡下的共定位得到證實(shí)。為了量化DVL2的相互作用如何受到泛素化的影響，作者進(jìn)行了SILAC-MS蛋白質(zhì)組分析，結(jié)果表明，CD型UL36-DVL2融合體（可穩(wěn)定泛素化）與蛋白酶體亞單位和VANGL1/cofilin的相互作用更大，而催化活性UL36-DVL2融合體（不能穩(wěn)定泛素化）與AP-2復(fù)合物的相互作用更大。

????????作者還使用SILAC-MS來量化DVL2的相互作用在usp9x敲除細(xì)胞中的變化。在usp9x敲除的細(xì)胞中，DVL2與VANGL1和cofilin的相互作用更多（DVL2泛素化升高），但在USP9X存在的情況下，DVL2與AP-2的相互作用更多（DVL2泛素化較少）。這些結(jié)果表明，泛素化的DVL2與VANGL1/cofilin--WNT-PCP途徑的組成部分有更多的相互作用，而去泛素化的DVL2與AP-2復(fù)合物有更多的相互作用，而AP-2復(fù)合物對規(guī)范的WNT激活至關(guān)重要。

研究結(jié)論：DVL2泛素化狀態(tài)與經(jīng)典WNT或WNT-PCP通路因子有關(guān)聯(lián)。

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7.USP9X調(diào)控DVL2的細(xì)胞分布并拮抗WNT-PCP? ? ?

????????VANGL1和cofilin在遷移的MDA-MB-231細(xì)胞中定位于富含F(xiàn)-actin的突起，DVL2是這些細(xì)胞中WNT5a誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移所必需的。作者認(rèn)為USP9X的缺失可能導(dǎo)致DVL2重新定位到MDA-MB-231細(xì)胞中富含肌動蛋白的突起。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者用免疫熒光顯微鏡來描述在有無USP9X的情況下FLAG-DVL2在MDA-MB-231細(xì)胞中的分布。在用對照siRNA處理的MDA-MB-231細(xì)胞中，DVL2在整個(gè)細(xì)胞體中呈點(diǎn)狀分布，而MDA-MB-231 siUSP9X敲除細(xì)胞顯示DVL2重新分布到富含肌動蛋白的突起。在有無USP9X的情況下，對DVL2的細(xì)胞分布進(jìn)行量化，發(fā)現(xiàn)失去USP9X后，DVL2在富含肌動蛋白的突起中明顯增加。重要的是，WWP1的敲除抑制了DVL2的重新分布，表明在沒有USP9X的情況下，DVL2重新分布到富含肌動蛋白的突起需要WWP1的活性。

????????WNT5a介導(dǎo)的PCP激活的一個(gè)特征是Rho激活，它依賴于DVL2，并且是WNT-PCP途徑誘導(dǎo)細(xì)胞遷移所必需的。鑒于作者的發(fā)現(xiàn)，作者假設(shè)DVL2在缺乏USP9X的MDA-MB-231細(xì)胞中重新分布到富含肌動蛋白的突起，可能會導(dǎo)致Rho的激活。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞通常表現(xiàn)出大約35%的最大Rho激活，而缺乏USP9X的細(xì)胞表現(xiàn)出50%的最大Rho激活。表面MDA-MB-231細(xì)胞中USP9X的缺失導(dǎo)致DVL2重新分布到富含肌動蛋白的突起和Rho激活。

研究結(jié)論：USP9X調(diào)控DVL2的定位并拮抗WNT-PCP的激活。

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8.USP9X以依賴DVL2泛素化的方式調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動能力? ???

????????已知VANGL1、cofilin和DVL2協(xié)調(diào)WNT-PCP的激活，以調(diào)節(jié)肌動蛋白的動態(tài)，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的運(yùn)動、遷移和轉(zhuǎn)移。因此作者認(rèn)為USP9X介導(dǎo)的對DVL2的調(diào)節(jié)可能會拮抗WNT-PCP介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)缺乏USP9X的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞與野生型的細(xì)胞相比，運(yùn)動能力明顯增加。? ? ?

????????作者假設(shè)，DVL2泛素化的提高可能有助于在USP9X基因敲除的MDA-MB-231細(xì)胞中觀察到的運(yùn)動性增加的表型。與這一假設(shè)一致，作者觀察到WWP1的敲除抑制了usp9x敲除細(xì)胞運(yùn)動性表型的增加。為了測試泛素化的作用，作者分析了穩(wěn)定表達(dá)DVL2-UL36（催化活性和CD）DUB融合蛋白的MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動性。作者發(fā)現(xiàn)敲除USP9X導(dǎo)致對照組細(xì)胞和表達(dá)CD DVL2-UL36融合蛋白的細(xì)胞的運(yùn)動能力增加，但表達(dá)催化活性DVL2-UL36融合蛋白的細(xì)胞則沒有。這一結(jié)果表明，在沒有USP9X的情況下觀察到的運(yùn)動能力增加的表型需要DVL2泛素化的增加。

????????最后，作者測試了DVL2泛素化是否是WNT5a誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞運(yùn)動的必要條件。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)CD DVL2-UL36的對照組細(xì)胞相比，表達(dá)具有催化活性的DVL2-UL36能顯著抑制WNT5a誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動?；谠摪l(fā)現(xiàn)，作者提出USP9X和WWP1對DVL2的活性平衡調(diào)節(jié)WNT途徑：USP9X介導(dǎo)的DVL2去泛素化促進(jìn)了典型的WNT信號傳導(dǎo)，WWP1介導(dǎo)的DVL2泛素化驅(qū)動了WNT-PCP的激活和細(xì)胞遷移。

研究結(jié)論：USP9X是MDA-MB-231細(xì)胞中PCP激活和細(xì)胞運(yùn)動的一個(gè)重要拮抗劑，而且這一功能依賴于DVL2的泛素化。

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結(jié)論與討論

????????作者確定了一種E3-DUB相互作用，其功能是對WNT途徑進(jìn)行分層調(diào)節(jié)。研究結(jié)果表明, WWP1和USP9X的活動是相互拮抗的其功能是在DVL2上建立一個(gè)泛素控制器，是WNT途徑規(guī)范的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。在功能上， USP9X拮抗WWP1對DVL2的活性，盡管作者的數(shù)據(jù)不能排除WWP1-USP9X相互作用在多泛素化的DVL2上發(fā)揮連鎖作用的可能性。最終，通過嚴(yán)格的生化分析，剖析了調(diào)節(jié)DVL2不同泛素化和去泛素化活動的平衡機(jī)制，這對于了解其在經(jīng)典或非經(jīng)典WNT信號途徑中的規(guī)范是如何確定的至關(guān)重要。

Thank you!

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.06.083