原理

通過顏色來顯示蛋白質(zhì)的有無，定位，以及含量變化的病理學(xué)常用技術(shù)

流程

材料

1，切片

石蠟切片厚度5微米，40攝氏度水溫展平組織后防脫玻片撈片，60攝氏度烘箱，烤片30分鐘

注意：對(duì)骨或者皮膚這些易脫片的組織，可適當(dāng)延長烤片的時(shí)間。

2，脫蠟至水

目的：目的是為了脫去組織石蠟，讓組織水化，易于孵育

二甲苯脫蠟三缸，每缸10分鐘

注意：具體時(shí)間根據(jù)室溫和二甲苯的新舊程度靈活調(diào)整

100%，85%，70%酒精各浸泡10分鐘

水洗：避免水流直接沖洗組織

3，滅活

目的：滅活內(nèi)源性過氧化物酶，減少對(duì)顯色系統(tǒng)的干擾

材料：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液

室溫孵育10分鐘

PBS緩沖液水洗3次，每次5分鐘

注意：對(duì)于內(nèi)源性過氧化物酶含量高的組織，可適當(dāng)延長孵育時(shí)間或增加過氧化氫濃度

4，抗原修復(fù)

目的：讓目的蛋白的結(jié)合表位暴露出來

材料：EDTA或檸檬酸修復(fù)液

EDTA微波熱修復(fù)5-8分鐘，冷卻至室溫

注意：樣本固定時(shí)間過久或陽性表達(dá)不強(qiáng)，可適當(dāng)增加修復(fù)的次數(shù)和強(qiáng)度。

5，封閉

目的：封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

材料：免疫組化筆

用此筆在玻片上畫圈防止試劑流出，滴加5%BSA或封閉血清，37攝氏度孵育30分鐘

6，一抗孵育

滴加一抗，37攝氏度孵育1-2小時(shí)

PBS緩沖液清洗三遍，每次5分鐘

注意：初次實(shí)驗(yàn)，建議做一抗做濃度梯度，以確定最佳的一抗稀釋比例

7，二抗孵育

滴加HPR標(biāo)記羊抗兔

37攝氏度孵育30分鐘

PBS緩沖液清洗三遍，每次5分鐘

注意：根據(jù)一抗種屬?zèng)Q定二抗的類型

8，顯色

材料：DAB顯色液

配置：1mlB液+1滴A液混勻

滴加DAB顯色液，鏡下觀察，控制顯色時(shí)間

之后終止反應(yīng)，水洗，玻片烘干

9，復(fù)染

材料：蘇木素染色液

蘇木素復(fù)染40秒，蒸餾水水洗，反藍(lán)液浸泡1分鐘，水洗

10，封片

材料：封片劑

依次70%，85%，100%酒精梯度脫水，每缸3分鐘

依次二甲苯透明，三缸，每缸2分鐘

晾干后中性樹膠封片，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果及拍照