? ? ? ?上期干貨中，為大家介紹了免疫共沉淀（Co-IP）的實驗原理和相關實驗操作步驟，這為讀懂Co-IP實驗結果的前提，因此本文針對Co-IP結果進行分析解讀，從結果圖注含義到實際案例逐一進行。

Co-IP實驗結果內容解讀

（1）下面是Co-IP實驗結果示例圖（非實際條帶，僅供參考）：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? B

圖1 Co-IP結果示例圖（A代表protein A和B有相互作用，B代表protein A和B之間不存在相互作用）

對結果進行分析之前，還需要了解圖中的標注都是什么含義：

IP：即指免疫沉淀（immunoprecipitation），用相應的抗體來純化富集目的蛋白，例如圖中“IP: Flag”的意思是用Flag標簽抗體磁珠去拉Flag，與Flag融合表達的蛋白為誘餌蛋白，此時與該融合蛋白相互作用的其他蛋白都會因此被沉淀下來。

IB：即指免疫印跡（immunoblotting）或western blot（WB），用來檢測目的蛋白的存在與否，例如圖中“IB: Flag”是指用Flag抗體做WB檢測，看樣本中是否存在Flag標記的蛋白，IB：Myc的含義同理；值得注意的是，抗體應使用兼容IP實驗的。

Iuput：指陽性對照組，是進行IP前制備蛋白樣本時預留下的部分樣品，做WB確認目的蛋白的存在，以排除假陽性結果的干擾。

（2）實驗結果圖分析：

?????? 了解結果圖圖注的含義后，咱們根據(jù)圖1 A和圖1B分析protein A和protein B的相互作用情況。protein A-Flag和protein B-Myc代表二者都融合了蛋白標簽，可通過蛋白標簽標記目的蛋白的存在。

①???? 圖1中的Input組是對細胞裂解液的蛋白樣本進行WB檢測，采用標簽蛋白Flag和Myc的抗體去驗證蛋白樣本中是否存在目的蛋白。圖1 A和B的Input結果均表示存在兩種目的蛋白。

②???? IP組是用含F(xiàn)lag抗體的磁珠進行免疫沉淀，將得到的沉淀復合物進行WB檢測，判斷protein A和protein B是否存在相互作用。圖1A的IP組結果顯示，在第三組沉淀復合物樣本中均檢測到了Myc和Flag，表明protein A和protein B之間存在相互作用；圖1B IP組的第三組樣本中只有Flag，而沒有檢測到Myc，代表protein A和protein B之間不存在相互作用。

文獻案例分析

?????? 了解Co-IP結果圖一般含義后，我們再結合文獻案例實戰(zhàn)分析Co-IP的結果。（案例均引自漢恒客戶發(fā)表的文章）

案例一：（目的蛋白不帶標簽進行Co-IP驗證）

圖2 BRD9和FOXP1之間存在相互作用[1]

?????? 根據(jù)結果圖信息，首先從最左邊的一列可以知道該結果是探討B(tài)RD9和FOXP1之間是否存在相互作用；并且二者都沒有帶標簽，因此IB檢測直接用針對目的蛋白的抗體；然后Input組為陽性對照，IgG為IP組的陰性對照，anti-FOXP1是IP的實驗組，即表示分別用IgG和FOXP1的抗體進行WB檢測蛋白復合物。結果顯示，Iuput組中均檢測到了BRD9和FOXP1，表明樣本存在這兩種蛋白；IP組中的IgG組未顯示條帶，排除非特異性結合的可能，而anti-FOXP1組在BRD9和FOXP1的條帶位置中均顯示，即沉淀復合物中存在這兩種蛋白，證明BRD9和FOXP1之間存在相互作用。

案例二：（目的蛋白融合標簽進行Co-IP驗證）

圖3 UHRF2和PRDX1之間存在相互作用[2]

?????? 作者在HepG2細胞中過表達Flag-UHRF2，驗證與內源PRDX1之間的相互作用情況，以Flag-Mock為空白對照組。UHRF2融合了Flag標簽，因此既可以檢測Flag來證明UHRF2的存在，也可以直接檢測UHRF2。同樣的，從Input組的條帶可知蛋白樣本中存在UHRF2和PRDX1；IP中的IgG組基本未顯示條帶，陰性對照正常。結果B過表達Flag-UHRF2后用帶Flag抗體的磁珠進行IP（第四列條帶），用PRDX1抗體做WB檢測，結果在PRDX1的位置出現(xiàn)條帶，表明UHRF2和PRDX1之間存在相互作用。結果C中的IP實驗組是用PRDX1抗體的磁珠去拉免疫復合物，分別用PRDX1抗體和UHRF2抗體做WB檢測。結果中無論是空白對照還是UHRF2過表達，PRDX1都必然會顯示條帶。UHRF2在空白對照和過表達組也都顯示出了條帶，表明不管是內源性還是外源性過表達的UHRF2都能與PRDX1相互作用。

案例三：（通過標簽標記，驗證蛋白互作的同時，探討可能的結合位點）

圖4 LRP6和CTSD之間存在相互作用，且LRP6（P1427Q）和CTSD（G316R）可能是二者相互作用的位點[3]

?????? 作者使用Flag標簽標記LRP6的野生型及其兩種突變體，His標簽標記CTSD的野生型及其突變體，驗證二者的相互作用和可能影響相互作用的位點。將LRP6的三種質粒分別與CTSD野生型質粒共轉至293T細胞，另外LRP6 WT與CTSD（G316R）質粒共轉，WB均使用標簽抗體顯示相應的目的蛋白。從Input組結果可以看出，每組均顯示了條帶，表明蛋白樣本表達正常。接著，IP組中的各組分別用含F(xiàn)lag抗體的磁珠和含His抗體的磁珠去拉沉淀復合物，WB再檢測Flag和His。IP: Flag結果顯示，前兩組中His均能檢測到明顯的條帶，表明LRP6和CTSD之間存在相互作用，LRP6的P1427Q突變并不影響二者的互作；LRP6（P1427Q）和CTSD WT共轉組、LRP6 WT和CTSD（G316R）共轉組的His明顯下降，說明LRP6的1427 P突變和CTSD的316 G突變會影響二者的互作。此外，IP: His的結果與之一致。因此，證明了LRP6和CTSD之間存在相互作用，且與LPR的1427 P和CTSD的316 G有關。

?????? 總之，Co-IP實驗結果分析不難，關鍵是熟知Co-IP的實驗原理和實驗步驟以及實驗分組的含義，再通過例子仔細耐心地實踐分析即可，希望本文能對大家閱讀Co-IP實驗結果有所幫助。漢恒生物專注病毒包裝，可提供多種帶標簽的載體，歡迎聯(lián)系咨詢~

參考文獻：

[1] Du J, Liu Y, Wu X, Sun J, Shi J, Zhang H, Zheng A, Zhou M, Jiang X. BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism. Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413. doi: 10.1038/s41467-023-37116-5.

[2] Zhang Y, Wu K, Liu Y, Sun S, Shao Y, Li Q, Sui X, Duan C. UHRF2 promotes the malignancy of hepatocellular carcinoma by PARP1 mediated autophagy. Cell Signal. 2023 Sep;109:110782. doi: 10.1016/j.cellsig.2023.110782.

[3] Wang X, Zou Y, Chen Z, Li Y, Pan L, Wang Y, Liu M, Yin C, Wu J, Yang C, Zhang L, Li C, Huang Z, Wang D, Qian J, Ge J, Zou Y, Gong H. Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 regulates cardiomyocyte-derived paracrine signaling to ameliorate cardiac fibrosis. Theranostics. 2021 Jan 1;11(3):1249-1268. doi: 10.7150/thno.48787.