注：本文不構(gòu)成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫(yī)療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。

前言

新冠疫情爆發(fā)后，核酸藥物成為醫(yī)藥領域的研發(fā)熱點，高分辨液質(zhì)聯(lián)用設備在核酸制品質(zhì)量研究方面的應用很廣，之前耀海生物陸續(xù)分享過其在mRNA加帽、加尾及Sequence Mapping方面的文章，有需要的小伙伴可以看回顧。

本次主要集中介紹高分辨質(zhì)譜設備在寡聚核苷酸類藥物質(zhì)量研究方面的應用。寡核苷酸藥物分為反義核酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、適配體（aptamer）等。當前研究資源主要集中反義核酸（ASO）和小干擾RNA（siRNA）藥物兩個方面，通常是由人工合成的長度50個以內(nèi)核苷酸組成的一類藥物，包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。通常靶向mRNA，從轉(zhuǎn)錄后水平進行治療，具有特異性好、有效性強和長效性突出的優(yōu)勢。

為了保證產(chǎn)品的安全性和有效性，寡核苷酸藥物通常需要從分子量、堿基序列、解鏈溫度Tm、產(chǎn)品純度、有關物質(zhì)等方面進行分析，其中分子量、堿基序列及有關物質(zhì)等均是其重要的產(chǎn)品屬性，常用的檢測方法是質(zhì)譜法。目前在寡核苷酸藥物表征方面使用的質(zhì)譜范疇很廣，低分辨質(zhì)譜及高分辨質(zhì)譜均有案例，其中高分辨質(zhì)譜主要集中在寡核苷酸藥物的高分辨分子量、堿基序列及藥物代謝的分析。寡核苷酸藥物極性較大，具有強烈的負電性，在常規(guī)的反相色譜條件下保留較弱，需要在流動相中添加離子對試劑1。自1997年六氟異丙醇HFIP被提出可以作為質(zhì)譜的酸性修飾劑使用后，其常與三乙胺TEA一起作為流動相對寡核苷酸藥物進行分析，如已上市的寡核苷酸藥物米泊美生(Mipomersen)，Sun等2將其作為鎖核酸(lockednucleicacid，LNA)米泊美生修飾的寡核苷酸模型，并開發(fā)了離子對反相液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的方法對大鼠血漿中的寡核苷酸進行定量。通過優(yōu)化TEA和HFIP離子對試劑的濃度會明顯改善目標物的色譜峰型，但隨著HFIP濃度的增加會導致離子抑制效應增強，對檢測的靈敏度產(chǎn)生不利的影響。2020年Goyon等3通過離子對反相色譜法和含有TEA和HFIP的流動相進行硫代磷酸酯寡核苷酸純度和雜質(zhì)分布的測定，也發(fā)現(xiàn)TEA會影響質(zhì)譜檢測的靈敏度，同時由于HFIP的腐蝕性和離子抑制作用會影響質(zhì)譜測定方法的耐用性，研究者們開始尋找離子對試劑的替代品。目前較常用的混合離子對試劑主要包括三乙基乙酸銨(TEAA)、三乙胺-六氟異丙醇(TEA-HFIP)、三乙胺/丙胺-乙酸鹽(TEA/PA-AA)以及N-乙基二異丙胺-六氟異丙醇（DIPEA-HFIP）等，不同離子對試劑體系下寡聚核苷酸的分離情況見圖1，使用超高效液相色譜儀器，6種不同的離子對試劑體系，均可以在7min的快速梯度下，對于寡核苷酸類物質(zhì)實現(xiàn)單一堿基的分離。研究人員根據(jù)不同的分析需求，在方法開發(fā)時會對不同的混合離子對試劑及不同的濃度配比進行優(yōu)化，以便于既能滿足測試需求，又能減輕因為使用離子對試劑對高分辨質(zhì)譜本身所造成的不利影響。

另外研究人員們也嘗試使用其他的色譜模式取代離子對反相，其中親水作用色譜HILIC的應用也并不少見。2021年Huang等5建立了HILIC-MS/MS的方法，對未修飾和完全硫代修飾的DNA寡核苷酸混合物及其合成的3'外切酶消化代謝物進行了高效分離，而后通過靶向選擇離子監(jiān)測(TSIM)系統(tǒng)分析了硫代寡核苷酸，靈敏度達13 ng(相當于2.0 pmol)。在檢測靈敏度方面基本可以與離子對反相相媲美，但因離子對反相色譜在選擇性分離相差1個堿基的ASO的代謝物方面優(yōu)于親水相互作用色譜6，故目前針對與寡核苷酸藥物的分子量、序列及藥物代謝方面，多數(shù)研究者更傾向于選擇離子對反相與高分辨質(zhì)譜串聯(lián)，該方法具有分離選擇性好、分析時間短、樣品用量少和溶劑消耗少等優(yōu)勢。

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