CRISPR-U?基因編輯細(xì)胞系原理

CRISPR-U?是源井生物自主研發(fā)的基因編輯技術(shù)（基于CRISPR / Cas9技術(shù)），CRISPR-U?技術(shù)比普通CRISPR/Cas9技術(shù)的基因切割效率更高，同時(shí)可以大幅度提升同源重組效率，輕松實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和動(dòng)物水平的基因敲除（KO）、基因點(diǎn)突變（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U?的技術(shù)優(yōu)勢，源井生物已成功在超過100種細(xì)胞系上實(shí)現(xiàn)基因編輯。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理是利用gRNA特異性識別靶序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶對靶序列的PAM上游進(jìn)行切割，從而造成靶位點(diǎn)DNA雙鏈斷裂，隨之利用細(xì)胞的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)DNA水平的敲除、敲入或點(diǎn)突變。

源井生物100種基因編輯細(xì)胞成功案例

技術(shù)優(yōu)勢

基因敲除細(xì)胞系

通過病毒法，化學(xué)轉(zhuǎn)染法或電轉(zhuǎn)法將gRNA和Cas9轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，根據(jù)轉(zhuǎn)染方法不同進(jìn)行不同時(shí)長的藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測序驗(yàn)證，篩選出基因敲除的陽性克隆。

常見基因敲除細(xì)胞系類型

敲除方案

源井生物根據(jù)客戶需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行敲除方案設(shè)計(jì)。

服務(wù)流程及質(zhì)量控制

應(yīng)用案例

中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞被用作生物工廠，用于生產(chǎn)一系列重組治療蛋白，包括單克隆抗體和Fc融合蛋白。宿主細(xì)胞蛋白（HCP）是必須從治療制劑中去除的雜質(zhì)，因?yàn)樗鼈兙哂袧撛诘拿庖咴燥L(fēng)險(xiǎn)。雖然在典型的下游凈化過程中，大多數(shù)HCP雜質(zhì)被有效去除，但清除少量存在的HCP仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立Anxa2和Ctsd基因敲除CHO細(xì)胞系，并證實(shí)了細(xì)胞裂解液中HCP完全消除。在培養(yǎng)過程中，所有的敲除細(xì)胞系都顯示出與野生型對照相似的生長和活力。因此，敲除非必需基因可以減少重組治療蛋白生產(chǎn)中HCP的污染。

用SDS-PAGE和WB分析鑒定CHO基因敲除細(xì)胞株的蛋白表達(dá)。

（a） Anxa2基因敲除細(xì)胞系。

（b） Ctsd敲除細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)上清液（47μg蛋白）和細(xì)胞裂解液（20μg蛋白）經(jīng)4-20%SDS-PAGE分析。

CBB染色檢測總蛋白。利用各自的捕獲和檢測抗體對每個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行WB分析。星號表示非特定波段。雙星號表示組織蛋白酶D的片段。

在蛋白質(zhì)表達(dá)分析中，沒有觀察到CHO-K1（WT）細(xì)胞系中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的膜聯(lián)蛋白A2和組織蛋白酶D。對貼壁的CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中沒有物理應(yīng)力誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，這表明CHO細(xì)胞分泌的這些蛋白質(zhì)數(shù)量相當(dāng)少。此外，在對Anxa2和Ctsd基因敲除細(xì)胞系的蛋白質(zhì)表達(dá)分析中，沒有觀察到任何截短的HCP。

Reference：

Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S.(2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of

contamination with host cell proteins.?Biotechnology progress, e2820.

來源 | 源井生物

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。

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