一、概念及應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，細胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應(yīng)用非常廣泛。

細胞轉(zhuǎn)染是指將外源遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）導(dǎo)入真核細胞的技術(shù)。細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

瞬時轉(zhuǎn)染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但持續(xù)時間只有幾天（數(shù)天內(nèi)大部分外源性 DNA 會在核酸酶作用下降解或被細胞分裂稀釋，一周后便無法再檢出）。使用超螺旋質(zhì)粒?DNA?進行瞬時轉(zhuǎn)染的效率最高，因為其能被細胞更高效地攝取。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：外源性DNA可以整合至細胞基因組中，或者作為游離型質(zhì)粒存在，并可傳遞至轉(zhuǎn)染細胞的子代。但通常只有單個或幾個拷貝的外源性DNA整合至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因組中，因此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因的表達水平一般低于瞬時轉(zhuǎn)染基因的表達水平。由于外源性DNA穩(wěn)定整合至基因組的概率很低，因此通常在用于轉(zhuǎn)染的DNA構(gòu)建體中納入可篩選標記物（如對各種篩選藥物產(chǎn)生抗性的基因，或是可對待轉(zhuǎn)染細胞系有缺陷的必需基因進行補償?shù)幕颍缓笤诙虝旱幕謴?fù)期后對細胞施加適當?shù)暮Y選壓力。

二、轉(zhuǎn)染方式

化學(xué)方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷，如陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法等。

生物方法---利用基因工程病毒轉(zhuǎn)染非病毒基因到細胞中，如病毒感染。（此方法將在下一節(jié)詳細介紹）

物理方法---在細胞膜表面產(chǎn)生一個瞬時的孔從而導(dǎo)入DNA，如電穿孔法。

三、常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點及步驟

以下簡單介紹目前實驗室最為常用的兩種方法。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞（見下圖）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前實驗室最方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。

特點：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點是能夠高效轉(zhuǎn)染許多細胞系，適用于高通量篩選，并能夠遞送任何大小的?DNA?以及?RNA?和蛋白。此外，該方法既可應(yīng)用于穩(wěn)定表達，也可應(yīng)用于瞬時表達，與其他化學(xué)方法不同的是，其可用于將?DNA?和?RNA?向動物和人體內(nèi)轉(zhuǎn)移；缺點是轉(zhuǎn)染效率依賴于細胞類型和培養(yǎng)條件，因此，需要對每種細胞類型的轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

實驗步驟：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

電穿孔法：利用電脈沖可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的膜上小孔，同時細胞膜上電勢升高，驅(qū)使帶電荷的分子（如?DNA）以類似于電泳的方式經(jīng)臨時微孔穿過細胞膜進入胞內(nèi)（見下圖）。當遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70%?的細胞。為確保轉(zhuǎn)染成功，針對實驗條件優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)是極為重要的。電場強度、脈沖形狀、脈沖施加次數(shù)、緩沖液組分等因素都會影響轉(zhuǎn)染效率。

特點：與其他轉(zhuǎn)染方法相比，電轉(zhuǎn)染具有諸多優(yōu)勢，其中主要優(yōu)勢包括：適用于所有細胞類型的瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；在確定最佳電轉(zhuǎn)染條件的情況下，能夠在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)染大量細胞。電轉(zhuǎn)的主要缺點在于高電壓脈沖可引起大量細胞死亡，僅部分細胞膜可以成功修復(fù)，因此相比化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)染需要使用更多數(shù)量的細胞。

實驗步驟：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測基因表達或沉默情況。

四、影響轉(zhuǎn)染效率的因素及注意事項

轉(zhuǎn)染效率受到多種因素影響，主要因素有以下幾種：

轉(zhuǎn)染試劑：不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，因此在轉(zhuǎn)染實驗前需要根據(jù)細胞特性選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑?？梢酝ㄟ^已發(fā)表文獻和轉(zhuǎn)染試劑提供的已成功轉(zhuǎn)染的細胞株來進行選擇。

細胞狀態(tài)：轉(zhuǎn)染前細胞活力和總體健康狀況是轉(zhuǎn)染產(chǎn)生變異性的重要來源。一般建議在轉(zhuǎn)染前至少24小時進行傳代培養(yǎng)，以確保細胞在傳代后處于轉(zhuǎn)染的最佳生理條件，細胞活力大于 90%。最適合轉(zhuǎn)染的細胞是復(fù)蘇經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。為確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性，一般選擇低細胞代次（<30，能確保基因型不變）。如果發(fā)現(xiàn)同一株細胞轉(zhuǎn)染效率降低，可以嘗試重新復(fù)蘇細胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。此外，污染會嚴重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

匯合度：轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達水平偏低。因此要根據(jù)具體的細胞類型、應(yīng)用和轉(zhuǎn)染技術(shù)，來優(yōu)化確定相應(yīng)的最佳密度。如使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞一般達到?70%-90% 的匯合度，懸浮細胞達到 5?×?105?至 2?×?106?個細胞/mL 的密度，即可獲得良好的結(jié)果。但不同的轉(zhuǎn)染試劑，針對不同細胞系要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不相同，因此使用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑時，應(yīng)進行實驗優(yōu)化并建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。不同實驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關(guān)基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉(zhuǎn)染的試劑。

培養(yǎng)基

不同的細胞或細胞類型都有非常特定的培養(yǎng)基、血清、補充劑要求，選擇最適合細胞類型的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染實驗中起著非常重要的作用。一些細胞系和原代細胞可能需要特殊的包被材料（如多聚賴氨酸、膠原蛋白、纖連蛋白等）以附著于培養(yǎng)板并獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。

可參考已發(fā)表文獻或細胞來源處獲得獲得針對特定細胞類型的合適培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法，如果沒有相關(guān)信息，則需要根據(jù)經(jīng)驗或篩選實驗確定。

血清

一般培養(yǎng)基中存在血清可增強?DNA 轉(zhuǎn)染。但使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時，一些血清蛋白會干擾復(fù)合物的形成，因此應(yīng)在無血清條件下制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。當使用 RNA 轉(zhuǎn)染細胞時，建議在無血清條件下轉(zhuǎn)染，以避免潛在的RNase污染。

抗生素

一般用于瞬時轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中可含抗生素。不過，由于陽離子脂質(zhì)體試劑可增加細胞通透性，因此也可能增加遞送到細胞內(nèi)的抗生素量，從而導(dǎo)致細胞毒性以及較低的轉(zhuǎn)染效率。因此不建議在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入抗生素?？稍谵D(zhuǎn)染前鋪板細胞時，使用無抗生素的培養(yǎng)基。

對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不應(yīng)在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是?Gibco Geneticin 選擇性抗生素的競爭性抑制劑。在構(gòu)建穩(wěn)定的細胞系時，在轉(zhuǎn)染程序后預(yù)留 48-72 小時供細胞表達抗性基因，之后再加入選擇性抗生素。

轉(zhuǎn)染分子類型：

質(zhì)粒?DNA 是最常用的轉(zhuǎn)染載體。質(zhì)粒 DNA 的拓撲結(jié)構(gòu)（線性或超螺旋）和大小會影響轉(zhuǎn)染的效率，超螺旋質(zhì)粒 DNA 瞬時轉(zhuǎn)染的效率最高。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，相對于超螺旋 DNA，雖然使用線性 DNA 會導(dǎo)致細胞的 DNA 攝取量較低，但 DNA 整合到宿主基因組中的效果更優(yōu)。雖然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白質(zhì)等其他大分子也可以轉(zhuǎn)染到細胞中，但在使用這些大分子時，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

五、總結(jié)

沒有一種方法適用于所有類型的細胞和實驗應(yīng)用，不同的方法在轉(zhuǎn)染效率、細胞毒性、對正常生理的影響、基因表達水平等方面均存在廣泛的差異。因此應(yīng)根據(jù)具體的細胞類型和實驗需求來選擇轉(zhuǎn)染方法，理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率、低細胞毒性、對正常生理的影響盡可能小、易于使用和高重復(fù)性。同時，應(yīng)根據(jù)該方法進行各種轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，以建立一個穩(wěn)定的實驗方案。

來源：“中科生命學(xué)堂”公眾號，作者~葉師兄；
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