前期，我們給大家分享了在神經(jīng)系統(tǒng)研究中AAV血清型和啟動(dòng)子的選擇『神經(jīng)研究中啟動(dòng)子和血清型這樣選！』，本期我們與各位老師繼續(xù)分享關(guān)于AAV注射方式的有關(guān)內(nèi)容。目前AAV在神經(jīng)系統(tǒng)研究中的注射方法主要有以下幾種：腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射、靜脈注射、腦室注射（ICV）、枕大池內(nèi)注射（ICM）和鞘內(nèi)注射（IT），其中ICV、ICM和IT注射是通過腦脊髓液進(jìn)行傳遞。每種注射方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者可根據(jù)具體的研究對(duì)象以及實(shí)驗(yàn)方案，選擇適合的注射方式，推薦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果做初步測試，以得到更優(yōu)的選擇方案。

表1.四種常用AAV神經(jīng)給藥特點(diǎn)

（Ocana-Santero G et al.?，International Journal of Molecular Sciences, 2021）

下面介紹幾種常用注射方法及相應(yīng)的病毒注射劑量：

01?腦立體定位注射

腦立體定位注射，相比其他注射方式靶向性強(qiáng)，注射病毒體積小，但是侵入性也強(qiáng)，且對(duì)操作者具有很高的要求。在立體定位手術(shù)時(shí)，顱骨上常用的注射參照點(diǎn)是前囪，也就是中矢狀冠狀縫的交叉點(diǎn)（下圖B中的十字交叉點(diǎn)）。具體操作步驟如下：

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重，進(jìn)行麻醉；

2. 待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全麻醉后，用剃毛器將動(dòng)物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發(fā)剃除干凈；

3. 將麻醉后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于腦立體定位儀上；

具體操作為：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護(hù)其雙眼；將門齒掛在門齒掛鉤上，確保頭部保持固定；檢查左右耳桿是否在同一水平上，將左右耳桿通過外耳道插入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳內(nèi)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定好的標(biāo)準(zhǔn)為：鼻對(duì)正中，頭部不動(dòng)，提尾不掉，目測大腦放置水平；

4. 手術(shù)：用碘伏/ 無色葡萄糖氯己定溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭皮進(jìn)行消毒清理，用手術(shù)刀沿中間位置剪開頭皮，用鑷子對(duì)表面的結(jié)締組織進(jìn)行清理，暴露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顱骨表面；然后進(jìn)行調(diào)平，首先找到前囟這個(gè)坐標(biāo)，并將其歸零，然后向左右調(diào)平，使左右兩側(cè)處于同一水平，調(diào)整前后囟，使前后囟也在同一水平；

5.?病毒注射：通過查詢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區(qū)的位置（下方圖片是大鼠和小鼠的腦譜），并確定其坐標(biāo)值，即ML 值（X 軸）、AP 值（Y 軸）、DV 值（Z 軸）；根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)設(shè)定好坐標(biāo)，移開注射針，用顱骨鉆開窗( 由于顱骨薄, 故務(wù)必注意顱骨鉆的力度??！),?操作時(shí)避免傷及腦組織；微量注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上，根據(jù)設(shè)好的坐標(biāo)進(jìn)行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μL/min，注射劑量視具體實(shí)驗(yàn)而定。注射完畢，留針10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回針；

6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動(dòng)物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動(dòng)物蘇醒后,正常喂養(yǎng), 病毒注射后2-4 周可檢測轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

提示：若手術(shù)麻醉時(shí)間較長，建議不要用酒精消毒，防止酒精揮發(fā)導(dǎo)致動(dòng)物體溫過低而死亡。手術(shù)過程和蘇醒過程注意保暖。

圖1. 腦立體定位注射示意圖

（Van der Perren A et al. JOVE-J VIS EXP. 2016）

02?鞘內(nèi)注射

與系統(tǒng)注射和實(shí)質(zhì)內(nèi)注射相比，鞘內(nèi)給藥是一種具有較低劑量要求的微創(chuàng)替代方法。步驟如下：

1、使用毛巾覆蓋在小鼠頭部和背部，露出髂嵴以下的腰部區(qū)域；用非慣用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髖骨)，手的頂部輕輕放在小鼠身體和頭部上，使其保持平靜。

注：在髂骨上的握力應(yīng)該足夠強(qiáng)，以固定小鼠的腿部活動(dòng)，并使腿部向外和向下伸展。

2、使用慣用手食指從腰椎到骶部沿脊柱輕輕按壓，同時(shí)使用非慣用手輕輕上拉小鼠，以打開椎節(jié)之間的空間，方便進(jìn)針。

3、將1 ?”號(hào)針的斜面指向小鼠頭部，然后將針以70°角插入脊柱中線的腰椎處，當(dāng)感覺針碰到骨頭時(shí)，將針的角度調(diào)整到30°夾角，并將針插入椎節(jié)之間。

注：需多次嘗試找到合適的進(jìn)入點(diǎn)，針頭進(jìn)入脊柱后推針沒有阻力，尾巴或后腿的反射性彈跳出現(xiàn)時(shí)，說明已正確入針。

4、輕輕壓下注射器的活塞，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛網(wǎng)膜下腔。

注：注射時(shí)間控制在10-30s較好，速度太快會(huì)導(dǎo)致小鼠后腿抽筋，該現(xiàn)象會(huì)在60s內(nèi)消失。

5、注射后，將針180°旋轉(zhuǎn)1-2次，然后將針從脊柱中取出。

6、小鼠放回籠子觀察，確認(rèn)恢復(fù)正常運(yùn)動(dòng)功能。

注：此法適用于成年小鼠或大鼠。

03?靜脈注射

系統(tǒng)性給藥方式，侵入性較小，但是相比其他注射方式特異性也較差，因此所需病毒體積更大。步驟如下：

（一）新生小鼠的顳靜脈注射

1、調(diào)整光源位置以便照亮顯微鏡區(qū)域，中等強(qiáng)度的光照為佳。

2、將一個(gè)新生幼鼠直接置于冰上1-3min，進(jìn)行麻醉。

3、當(dāng)動(dòng)物在冰上麻醉時(shí)，在注射器中注滿AAV病毒，注射體積不應(yīng)超過100μL。

4、在顯微鏡下觀察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻處，中指放在耳芽處，以便拉伸幼鼠的皮膚，可見顳淺靜脈。

5、確定顳淺靜脈?？赏ㄟ^皮膚看到位于耳芽前部，周圍毛細(xì)血管下部，有一條隱約可見的靜脈血管，從背部到腹部，匯入頸靜脈，這就是顳淺靜脈。

6、注射器針尖斜面插入顳靜脈?？梢钥吹结樇庑泵嫱ㄟ^皮膚的以后被血填充。輕壓注射器，并注意幼鼠臉側(cè)面的靜脈變白。

（二）成年小鼠眶后靜脈注射

1、注射異氟醚對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，使用非慣用手手掌握住小鼠背部，將拇指放在氣管正側(cè)面，頭部皮毛攏至手掌，使小鼠眼球凸起。

2、將手腕支撐在穩(wěn)定的表面上，用拇指、中指和無名指握住注射器，將食指放在柱塞上方。

3、對(duì)小鼠施加輕微壓力使眼睛凸出，針頭對(duì)準(zhǔn)內(nèi)眥，斜面朝外，將針頭以45°插入眶后竇中心約5mm；

4、使用0.5ml 28G注射器緩慢注入150-200μL病毒懸液；

5、緩慢地取出針頭，確保針頭不會(huì)劃傷眼角膜。使用無菌紗布止血，并在眼睛上涂抹藥膏助其恢復(fù)。

6、注射后，將小鼠放回籠中恢復(fù)直至清醒。

圖2. 成年小鼠眶后靜脈注射

（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）

（三）尾靜脈注射

1、將小鼠放入約束器中，使尾巴從開口處露出。避免過度限制小鼠，以免導(dǎo)致其呼吸受阻。

2、在尾部涂抹70%異丙醇。

3、將小鼠尾巴拉直，可看到尾巴兩側(cè)各有一條側(cè)脈。

4、將針尖以30°角插入側(cè)靜脈中。一旦針尖穿過了靜脈的一半，重新調(diào)整針頭，使其與靜脈的長度一致(圖3c)。如果針頭插入正確，則按壓注射器注射時(shí)應(yīng)無阻力。

5、使用0.5ml 28G注射器緩慢注射300μLAAV病毒懸液，此時(shí)靜脈顏色會(huì)變白，大約4s后，顏色恢復(fù)正常。

6、小心將針頭取出，用吸水紗布按壓注射部位10秒進(jìn)行止血。

7、將小鼠放回籠子。

圖3. 尾靜脈注射

（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）

注：本期分享來源于文獻(xiàn)，如有錯(cuò)誤及不足之處，歡迎各位老師批評(píng)指正。

04?參考文獻(xiàn)

[1]Ocana-Santero G , Javier Díaz-Nido, Saúl Herranz-Martín. Future Prospects of Gene Therapy for Friedreich's Ataxia[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4):1815.

[2]ZMD Jingdong, XMD Huangui. Brain Stereotaxic Injection[J]. Springer New York, 2014.

[3]Cristina, D, Peterson, et al. AAV-Mediated Gene Delivery to the Spinal Cord by Intrathecal Injection.[J]. Methods in Molecular Biology, 2019.

[4]Gessler D J , ?Tai P , ?Jia L , et al. Intravenous Infusion of AAV for Widespread Gene Delivery to the Nervous System[M]. ?2019.