上一期奧維森科技：微生物組學(xué)測(cè)序送樣指南①中已經(jīng)給大家介紹了一些微生物常見(jiàn)樣本類型的收集流程及相關(guān)送樣建議。但在科學(xué)研究中，也有很多老師會(huì)涉及一些非常規(guī)樣本，而這些樣本往往較難收集或收集方法較復(fù)雜。本期小編繼續(xù)為大家整理了微生物非常規(guī)樣本類型的收集流程，以供大家查閱參考！

生物類樣本微生物取樣方法

（一）不同類型樣本建議送樣量

（二）不同類型樣本收集流程

1、舌 苔

取樣前禁食、禁煙酒等，用無(wú)菌水漱口多次，以除去食物殘?jiān)Ｖ笥脽o(wú)菌拭子沿舌根向前滾動(dòng)刷取舌苔30次，刷取后的無(wú)菌拭子浸入含有生理鹽水或PBS緩沖液的離心管中，攪拌拭子多次，以確保拭子上的微生物盡可能多的轉(zhuǎn)移到緩沖液中。緩沖液4℃、5000 g離心5 min，棄去上清液，取沉淀于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

可重復(fù)擦拭操作幾次，合并多次采集的樣本，以確保收集的舌苔樣本充足。

2、鼻腔分泌物

用無(wú)菌拭子輕輕擦拭鼻腔黏膜表面，每個(gè)鼻孔采用同一個(gè)拭子在相同區(qū)域擦拭兩次。左、右側(cè)鼻孔樣本作為組合樣本進(jìn)行取樣和匯集，并做好標(biāo)記。擦拭后立即將棉簽置于含有生理鹽水或PBS緩沖液的離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

3、呼吸道

（1）上呼吸道

①?鼻腔取樣

將潔凈的拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。以另一拭子擦拭另側(cè)鼻道內(nèi)鼻腭。擦拭后立即將棉簽置于含有生理鹽水或PBS緩沖液的離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

②?咽喉取樣

讓患者深呼吸張開(kāi)口腔，發(fā)“啊”音，用壓舌板輕輕壓舌，將潔凈的咽拭子來(lái)回擦拭雙側(cè)扁桃體及咽后壁。擦拭后立即將棉簽置于含有生理鹽水或PBS緩沖液的離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.咽喉取樣時(shí)，拭子不能接觸到口腔和舌粘膜。

b.取樣時(shí)間最好在發(fā)病72 h內(nèi)，晨起后。

c.鼻腔和咽部樣品，可只收集一種，也可同時(shí)收集2種并混合。

（2）肺組織

收集切除的病變組織和病理診斷所要求的組織樣品，用生理鹽水或無(wú)菌水清洗，去除淤血或其它臟物，放入凍存管中，液氮速凍后于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.由臨床醫(yī)生和病理醫(yī)師在進(jìn)行手術(shù)過(guò)程中切除獲取組織樣本，切除樣本前準(zhǔn)備好組織收集容器、組織切割工具和保存分割的組織樣本塊的凍存管。

b.確保正確采集病變組織和非病變對(duì)照組織（如腫瘤附近約1-5 cm），且不會(huì)對(duì)參與者產(chǎn)生不利影響。

c.記錄下手術(shù)切除部位和其它組織樣本相關(guān)的手術(shù)信息。

d.肺組織樣本應(yīng)在手術(shù)切除后20 min內(nèi)，進(jìn)行液氮速凍。

e.取材時(shí)避免取到腫瘤壞死部位和不具有代表性部位的組織。

（3）肺泡灌洗液

①?人肺泡灌洗液

對(duì)擬要灌洗肺段經(jīng)活檢孔做局部麻醉，利用纖維支氣管鏡對(duì)肺中支氣管用37℃滅菌生理鹽水多次灌洗，可每次30-50 mL，總量100-250 mL，不超過(guò)300 mL。每次注液后用合適的負(fù)壓吸引獲取肺泡灌洗液，一般回收率應(yīng)達(dá)注入液量的40%-60%。灌洗液用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，除去粘液和較大雜質(zhì)，裝入無(wú)菌離心管或其他無(wú)菌容器中。灌洗液4℃、20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲(chǔ)存；或者將灌洗液用0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾，濾膜裝入離心管中于-80℃儲(chǔ)存。

②?小鼠肺泡灌洗液

小鼠經(jīng)麻醉固定后，從頸部切口，暴露剝離氣管，剪開(kāi)氣管的1/2，行氣管插管，用1 mL注射器抽取1 mL的生理鹽水，通過(guò)氣管插管注入氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸三次，將液體抽出收集于無(wú)菌離心管內(nèi)。再抽取1 mL生理鹽水，重復(fù)上面的操作兩次。灌洗液4℃、20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲(chǔ)存；或者將灌洗液用0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾，濾膜裝入離心管中于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.推薦使用的負(fù)壓為-13.3 - -19.95 kpa，要防止負(fù)壓過(guò)大過(guò)猛。

b.小鼠采樣時(shí)一般為頸部和胸部解剖，氣管和一側(cè)肺葉結(jié)扎，再用穿刺針插入氣管上端，針頭不要插太深，以免損傷肺。

c.小鼠采樣時(shí)如果回收遇到很大的阻力即可拔出注射器，收集灌洗液。在灌洗的時(shí)候可以輕輕的按摩一下，特別是回抽的時(shí)候這樣做能夠提高回收的效率。

4、母乳

用手輕輕擠壓乳頭及乳房刺激泌乳反射，當(dāng)母乳開(kāi)始流動(dòng)時(shí)，丟掉第一滴后用無(wú)菌吸乳器收集母乳，采集約20 mL左右放入無(wú)菌容器中，于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.采樣人員不留長(zhǎng)指甲，徹底洗凈雙手。

b.樣品采集前，用肥皂和水清洗乳房，或用酒精擦拭表面。

5、陰道

用滅菌棉拭子（可用無(wú)菌生理鹽水濕潤(rùn)）在陰道后穹隆、中間點(diǎn)、入口處沿壁多次擦拭（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇取樣部位），每個(gè)樣本2-3個(gè)拭子。取樣完成后將棉拭子頭放入采集管內(nèi)于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.取樣前7 d不能使用陰道或外陰藥物；取樣前48 h內(nèi)，避免使用加氯消毒的游泳池或浴盆。

b.女性測(cè)試者必須在非生理期取樣，取樣前不要進(jìn)行性行為，不要使用避孕藥、栓劑、女性噴霧劑等。

c.注意要丟棄有出血的樣品。

6、血液

推薦使用EDTA抗凝的采血管收集全血樣本，采集后將血液收集于無(wú)菌凍存管中于，-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.不要選擇肝素或肝素鈉作為抗凝劑，取血后，顛倒混勻幾次。

b.不要直接使用BCT管凍存，以免破損。

7、尿液

用肥皂水以及酒精對(duì)尿道口周圍進(jìn)行清洗，采集中段尿液40 mL左右于無(wú)菌容器中?；蚴褂脽o(wú)菌導(dǎo)尿管，從膀胱中采集尿液。建議尿液4℃、20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)：

a.女性留取尿樣本時(shí)應(yīng)避開(kāi)經(jīng)期，并防止陰道分泌物混入尿液。

b.中段尿：在排尿過(guò)程中，棄去前、后時(shí)段排出的尿液。

8、膽囊

（1）膽結(jié)石

在開(kāi)腹膽囊切除術(shù)或腹腔鏡膽囊切除術(shù)中，從患者膽囊中取出結(jié)石，并用無(wú)菌的一次性鋼刀對(duì)結(jié)石進(jìn)行四邊形切割。然后用新的外科刀片松開(kāi)結(jié)石內(nèi)部，采集結(jié)石內(nèi)部放入無(wú)菌離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

（2）膽汁

在開(kāi)腹膽囊切除術(shù)或腹腔鏡膽囊切除術(shù)中，用一次性無(wú)菌針管或無(wú)菌導(dǎo)管吸取膽囊膽汁到無(wú)菌離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

9、石蠟切片

于無(wú)菌環(huán)境下，用無(wú)菌針頭或顯微切割方法，切取石蠟切片中間部分組織于無(wú)菌離心管中，-80℃儲(chǔ)存。一般單個(gè)切片為單個(gè)樣本。

環(huán)境類樣本微生物取樣方法

（一）不同類型樣本建議送樣量

（二）不同類型樣本收集流程

1、土壤結(jié)皮

選擇樣點(diǎn)后，除去生物土壤結(jié)皮表面的落葉，用無(wú)菌鑷子夾取表層結(jié)皮，并用小刀盡量刮掉結(jié)皮背面粘附的尾礦。采用多點(diǎn)取樣法，采集重量相當(dāng)?shù)慕Y(jié)皮樣本進(jìn)行均勻混合，于-80℃儲(chǔ)存。

2、海洋、河流沉積物

根據(jù)研究目的選擇合適地點(diǎn)的沉積物樣本進(jìn)行取樣，一般建議取10 g以上，置于無(wú)菌離心管中，于-80℃儲(chǔ)存。

3、堆肥

在各處理堆體的頂部、中部和底部取三個(gè)子樣品（每個(gè)子樣品約50 g，濕重），混合均勻后形成一個(gè)混合樣品（約150 g，濕重），分裝為多管備份后于-80℃儲(chǔ)存。

4、廚余垃圾

根據(jù)研究設(shè)計(jì)選擇適當(dāng)?shù)膹N余垃圾，挑去大塊雜質(zhì)后經(jīng)過(guò)攪碎裝入無(wú)菌離心管中，每個(gè)樣品取樣2-10 g，于-80℃儲(chǔ)存。

5、巖石、沙礫類

將收集的石子、沙礫、煤塊等類型樣本置于50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入PBS緩沖液后漩渦振蕩，使微生物從樣本表面充分脫落并聚集在PBS緩沖液當(dāng)中。緩沖液4℃、20000 rcf高速離心10 min，取沉淀于-80℃儲(chǔ)存；或者將緩沖液用0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾，濾膜裝入離心管中于-80℃儲(chǔ)存。

樣品收集、儲(chǔ)存、寄送基本原則

1、嚴(yán)格無(wú)菌操作：樣品采集所用工具、收集管均需滿足無(wú)菌條件，取樣環(huán)境如不能滿足無(wú)菌條件也應(yīng)盡量清潔；

2、取樣時(shí)盡量避免樣本受到干擾，盡量縮短保存和運(yùn)輸時(shí)間，以保證樣品原始狀態(tài)的微生物群落組成狀態(tài)；

3、樣品收集管密封嚴(yán)實(shí)（封口處用封口膜封好）后儲(chǔ)存于-80℃；

4、送樣優(yōu)先選擇新鮮采集的樣本，其次才是凍存樣本；

5、用于DNA樣品制備實(shí)驗(yàn)的樣品前處理或切割分裝過(guò)程盡可能在冰上快速進(jìn)行，避免因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致樣品降解；

6、樣品凍存期間，避免反復(fù)凍融；

7、寄送時(shí)用大體積干冰運(yùn)輸，且要保證在收到樣品開(kāi)箱檢驗(yàn)時(shí)有足夠的干冰剩余；

8、樣品標(biāo)記清晰且與樣品信息單一致，管蓋管身均需寫上標(biāo)記，自封袋建議在兩個(gè)及以上的不同位置都寫上標(biāo)記。

以上就是小編精心梳理的微生物非常規(guī)樣本類型的收集流程及注意事項(xiàng)啦！合格的樣本是準(zhǔn)確獲取樣本微生物組數(shù)據(jù)和項(xiàng)目順利完成的基礎(chǔ)，因此規(guī)范的取樣及送樣真的很重要。我們接收樣本后，如果發(fā)現(xiàn)任何異常，也會(huì)及時(shí)跟老師溝通并反饋樣本情況。如果您對(duì)于微生物組學(xué)送樣方面還有疑惑，請(qǐng)與小編聯(lián)系，歡迎各位老師前來(lái)咨詢！