癌癥的生存和發(fā)展取決于腫瘤細(xì)胞逃避免疫識(shí)別的能力，隨著對(duì)癌癥免疫和腫瘤免疫逃逸機(jī)制的深入理解，使得免疫治療法的發(fā)展成為可能。一些無(wú)法治愈的癌癥轉(zhuǎn)移性患者中，免疫治療產(chǎn)生了前所未有的應(yīng)答率，具有持久的完全應(yīng)答的潛力。然而，原發(fā)性和獲得性耐藥機(jī)制限制了免疫治療的效果，進(jìn)一步的免疫治療發(fā)展需要更深入地了解免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用。

2023年1月4日，由哥本哈根大學(xué)諾和諾德基金會(huì)蛋白質(zhì)研究中心的科學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Seminars in Immunopathology ( IF=11.759 )期刊上題為“Proteomics tostudy cancer immunity and?improve treatment”的文章，本篇綜述討論了基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤免疫和癌癥免疫治療背景下的臨床前和臨床研究方面的潛在貢獻(xiàn)。

基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)于1988年首次被引入，現(xiàn)在是最全面的方法用于定量分析蛋白質(zhì)、研究蛋白與蛋白之間相互作用、亞細(xì)胞定位以及用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）等。

基于MS的腫瘤免疫研究的蛋白質(zhì)組學(xué)臨床樣本類型通常有：腫瘤活檢組織、熒光激活細(xì)胞分選（FACS）的細(xì)胞、患者來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)物、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）、血漿等。

腫瘤活檢組織的深層蛋白質(zhì)組學(xué)分析

Harel等人的一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性研究代表了對(duì)免疫治療反應(yīng)的最早的深度蛋白質(zhì)組學(xué)分析。作者分析了116例福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織的蛋白質(zhì)組，這些活檢組織來(lái)自接受TIL或抗PD1免疫治療的IV期黑色素瘤患者。生信分析顯示在兩種治療中，應(yīng)答者的氧化磷酸化和脂質(zhì)代謝均高于非應(yīng)答者。FFPE蛋白質(zhì)組學(xué)分析的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)樣本進(jìn)行回顧性分析，但這也存在一些缺點(diǎn)，首先FFPE組織切片中PTM沒(méi)有被完全保存。其次會(huì)丟失了所有關(guān)于腫瘤微環(huán)境(TME)復(fù)雜性的信息。

為了克服第一個(gè)限制，組織標(biāo)本可以在收集后立即快速冷凍并進(jìn)一步冷凍粉碎。這種策略將允許深度磷酸化蛋白質(zhì)組分析，隨后可以與免疫分析整合。為了克服第二個(gè)限制，生物信息學(xué)反褶積法可用來(lái)識(shí)別大塊腫瘤內(nèi)的不同細(xì)胞群。

FACS分選的細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析

另一種處理TME復(fù)雜性和腫瘤異質(zhì)性的潛在方法是FACS分選細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。目前已經(jīng)提出了多種樣品制備方案，如Amon等人基于基于DIA的無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法，將肽檢測(cè)量降低到300 ng，相當(dāng)于25000個(gè)已分類的細(xì)胞。

另外，來(lái)自TME的細(xì)胞在蛋白質(zhì)組學(xué)分析之前可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)，這種體外實(shí)驗(yàn)可用于降低TME的復(fù)雜性，提高蛋白含量以便于進(jìn)行深度蛋白質(zhì)組學(xué)分析。原代細(xì)胞可以被TME中產(chǎn)生的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子（如IFN-γ和TNF-α）刺激，為了揭示關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)參與者，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)可能是一種有趣的應(yīng)用方法。另一個(gè)潛在的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用涉及到蛋白質(zhì)間相互作用的研究。純化的原代小鼠T細(xì)胞已被用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

免疫肽組學(xué)用于T?細(xì)胞免疫反應(yīng)靶標(biāo)鑒定

腫瘤免疫研究中，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)最有前途的應(yīng)用之一是通過(guò)免疫肽組學(xué)識(shí)別腫瘤抗原，即對(duì)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的人類白細(xì)胞抗原（HLA）結(jié)合肽的質(zhì)譜分析。腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)對(duì)于開(kāi)發(fā)為患者量身定制的免疫療法至關(guān)重要，如CAR-T細(xì)胞療法和癌癥疫苗。T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別需要HLA分子在抗原呈遞細(xì)胞（APCs）表面呈遞腫瘤抗原。HLA-I類（HLA-I）分子呈遞的多肽主要來(lái)自于內(nèi)源性抗原肽，并與CD8 + T細(xì)胞相互作用。HLA-II類（HLA-II）分子呈現(xiàn)呈遞是由內(nèi)吞/內(nèi)噬蛋白降解的多肽，并與CD4 + T細(xì)胞相互作用。免疫肽群主要由來(lái)自自身“正?！钡鞍椎亩嚯暮鸵恍〔糠帜[瘤特異性多肽組成。

血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

血漿由于其可獲得性和相對(duì)穩(wěn)定性，是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)有吸引力的樣本來(lái)源。事實(shí)上，它是測(cè)量大多數(shù)與宿主免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的首選樣本類型，包括細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體蛋白和免疫球蛋白。利用質(zhì)譜分析血漿樣本的主要挑戰(zhàn)是蛋白質(zhì)豐度的極端動(dòng)態(tài)范圍。高豐度蛋白（如白蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白）占蛋白總量的99%，進(jìn)而掩蓋低豐度蛋白的信號(hào)。不同的策略已經(jīng)被用于減少豐度的動(dòng)態(tài)范圍，增加血漿中低豐度蛋白的識(shí)別(圖3)。選擇性去除高豐度蛋白如白蛋白和免疫球蛋白，會(huì)增加蛋白質(zhì)的檢測(cè)數(shù)量，但會(huì)影響樣本的完整性，因?yàn)樵S多可溶性蛋白與白蛋白結(jié)合。另一種增加血漿蛋白質(zhì)組深度的方法是富集細(xì)胞外囊泡（EVs），檢測(cè)位于EV中的細(xì)胞內(nèi)蛋白和膜蛋白，為分析提供了一個(gè)新的生物學(xué)思路。

還有一種方法是通過(guò)非特異性結(jié)合與納米顆粒來(lái)選擇性富集低豐度蛋白。將不同的納米顆粒與不同的表面化學(xué)成分結(jié)合時(shí)，可以從血漿樣本中定量多達(dá)2000種蛋白質(zhì)。

未來(lái)的展望

采用質(zhì)譜法進(jìn)行單細(xì)胞分析

為了更深入地了解癌癥免疫，基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將很快被應(yīng)用于單細(xì)胞水平的TME研究?；蚪M中的DNA或RNA可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，相反蛋白和肽信號(hào)不能以類似的方式擴(kuò)增，因此，用于分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜儀需要具有高靈敏度來(lái)檢測(cè)低細(xì)胞豐度的蛋白質(zhì)。為了克服單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的一些挑戰(zhàn)，采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）技術(shù)，通過(guò)在每一個(gè)TMT通道中加入數(shù)百個(gè)細(xì)胞作為載體蛋白組從而增加MS信號(hào)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的另一種替代策略是最近引入的深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)（DVP），它將先進(jìn)的顯微技術(shù)和數(shù)字病理學(xué)以及基于MS的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和人工智能結(jié)合在一起。DVP在表征腫瘤組織異質(zhì)性和TME的研究方面特別有前景。它將人工智能驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞表型圖像分析與自動(dòng)化的單細(xì)胞或單核激光顯微解剖以及超高靈敏度質(zhì)譜相結(jié)合，能夠在保留空間背景信息的同時(shí)分析來(lái)自單細(xì)胞類型的數(shù)千種蛋白質(zhì)。此外，作者還綜述了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)是在單細(xì)胞水平上評(píng)估免疫系統(tǒng)的理想平臺(tái)，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)，并在單細(xì)胞水平上研究免疫系統(tǒng)，也是流式細(xì)胞技術(shù)一個(gè)新的發(fā)展方向。