研究背景

乳腺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中三陰性乳腺癌(TNBC)是一種難以治愈的類型，由于缺乏靶向藥物，目前化療仍是TNBC治療的主要手段。

雖然免疫治療策略在治療各種癌癥方面已顯示出令人鼓舞的結(jié)果，然而，TNBC細(xì)胞通過(guò)降低其免疫原性來(lái)逃避宿主免疫系統(tǒng)，而免疫原性降低了腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的浸潤(rùn)，化療有時(shí)可通過(guò)釋放損傷相關(guān)的分子模式分子(DAMPs)誘導(dǎo)免疫原性凋亡，增強(qiáng)腫瘤的免疫原性。然而，大多數(shù)化療呈“無(wú)聲死亡”過(guò)程，導(dǎo)致免疫反應(yīng)微弱。

焦亡是細(xì)胞程序性死亡的一種促炎形式，它依賴于Gasdermin N端蛋白形成的質(zhì)膜孔，最終釋放大量的細(xì)胞內(nèi)容物并引起有效的免疫應(yīng)答。例如，化療通常通過(guò)上調(diào)caspase-3的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。如果腫瘤細(xì)胞表達(dá)GSDME, caspase-3可以將GSDME裂解至GSDME-C(GSDME C-末端)和GSDME- N (GSDME N -末端)，使非炎性化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為炎性焦亡，激活抗腫瘤免疫。然而，GSDME在包括TNBC在內(nèi)的許多癌癥中被下調(diào)，即使在cleaved caspase-3過(guò)表達(dá)后也能阻止細(xì)胞焦亡。

文獻(xiàn)來(lái)源

2023年5月，中山大學(xué)帥心濤課題組在《NANO LETTERS》期刊發(fā)表文章：Nanodrug Augmenting Antitumor Immunity for Enhanced TNBC Therapy via Pyroptosis and cGAS-STING Activation。

該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種新型納米脂質(zhì)體(GM@LR)，并利用其將表達(dá)GSDME的質(zhì)粒和羰基錳(MnCO)共同遞送到TNBC細(xì)胞中。在H2O2存在下，MnCO生成Mn2+和一氧化碳(CO)。CO活化的caspase-3切割表達(dá)的GSDME，使凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡。此外，Mn2+通過(guò)激活STING信號(hào)通路促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)的成熟。瘤內(nèi)成熟樹(shù)突狀細(xì)胞比例增加，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，引發(fā)強(qiáng)烈地免疫反應(yīng)從而有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

納米脂質(zhì)體的特性

經(jīng)測(cè)定表明GM@LR在H2O2存在下可以形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物并生成CO。CO可觸發(fā)凋亡通路，納米藥物內(nèi)化后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

通過(guò)YOYO-1標(biāo)記的pGSDME(綠色)來(lái)跟蹤GM@LR通過(guò)4T1細(xì)胞的內(nèi)在化，結(jié)果顯示內(nèi)化的GYOYO- 1M@LR納米顆粒最初被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，然后pGSDME被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核(圖1H和I)。由于MnCO產(chǎn)生的CO在細(xì)胞內(nèi)的積累可以通過(guò)促進(jìn)ROS的生成來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此作者通過(guò)CLSM和流式細(xì)胞儀使用DCFH-DA探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS水平，GM@LR組處理后的細(xì)胞中ROS相關(guān)熒光最強(qiáng)。

項(xiàng)目研究

裝載MnCO的納米治療(M@LR和GM@LR)導(dǎo)致4T1細(xì)胞活力降低(圖2A)。GM@LR與M@LR相比也沒(méi)有增加細(xì)胞死亡率，這表明添加pGSDME并不會(huì)導(dǎo)致額外的細(xì)胞毒性。在MnCO納米藥物處理的4T1細(xì)胞中檢測(cè)到活化的caspase-3(圖2D)。此外，經(jīng)GM@LR處理的細(xì)胞表現(xiàn)出典型的細(xì)胞焦亡跡象，即腫脹和細(xì)胞膜破裂(紅色箭頭表示)，GSDME- N蛋白表達(dá)顯著增加。僅在GM@LR處理后的培養(yǎng)基中，乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著升高(圖2G)，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞發(fā)生了焦亡。隨后分析了GM@LR治療后HMGB1和ATP水平均顯著增加。

為了監(jiān)測(cè)納米藥物對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響，將未成熟的骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)與處理后的4T1細(xì)胞的上清液一起培養(yǎng)。GM@LR組成熟DC (CD80+/CD86+)的百分比顯著增加(圖2K)，MHC-II表達(dá)也顯著上調(diào)(圖3L)，即表明DC成熟，抗原呈遞能力增強(qiáng)。如圖2M所示，裝載MnCO納米藥物的BMDCs (M@LR和GM@LR)中，STING水平下調(diào)，cGAS和p-IRF3水平明顯上調(diào)，表明cGAS-STING信號(hào)通路被激活。

以上得出，GM@LR誘導(dǎo)焦亡的4T1細(xì)胞釋放大量?jī)?nèi)源性DAMPs(HMGB1和ATP)和上調(diào)CRT，隨著Mn2+激活cGAS-STING信號(hào)通路，成熟DCs的比例增加（圖2N）。

當(dāng)原位腫瘤生長(zhǎng)到約50mm3時(shí)，用不同的制劑(PBS、G@LR、M@LR和GM@LR)處理小鼠，并根據(jù)腫瘤體積和重量評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性。如圖3F?H所示，使用GM@LR治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制最大，這與最長(zhǎng)的生存期相吻合(圖3I)。此外，GM@LR對(duì)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的抑制作用也最為明顯(圖3J)。進(jìn)一步分析了GSDME-N在腫瘤組織中的表達(dá)。GSDME在裝載pGSDME納米藥物的腫瘤中表達(dá)(G@LR和GM@LR)，而GSDME- N僅在GM@LR組中表達(dá)(圖3K)。因此，GM@LR誘導(dǎo)的腫瘤焦亡導(dǎo)致DAMPs暴露，可能導(dǎo)致更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

為了進(jìn)一步證實(shí)GM@LR的抗腫瘤作用是一種有效的免疫反應(yīng)的結(jié)果，隨后測(cè)量了不同組的腫瘤免疫微環(huán)境。如圖4所示GM@LR組中成熟的TIDC比例最高，對(duì)應(yīng)的腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞比例也最高。其次，由于Mn2+促進(jìn)TIDC的成熟，GM@LR誘導(dǎo)的焦亡在腫瘤部位引起了強(qiáng)烈的局部免疫反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為顯著的腫瘤消退。通過(guò)建立了4T1肺轉(zhuǎn)移模型來(lái)證實(shí)GM@LR還能激發(fā)抗腫瘤免疫記憶，有效地防止腫瘤轉(zhuǎn)移。

肝轉(zhuǎn)移是乳腺腫瘤常見(jiàn)的臨床癥狀。作者建立了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型(圖5A)。靜脈注射GM@LR后，MRI T1加權(quán)像(T1WI)增強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)到界限清楚的高信號(hào)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(圖5B)，提示GM@LR可以幫助MRI監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移。術(shù)后3天對(duì)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠進(jìn)行治療(圖5C)，在GM@LR處理小鼠中檢測(cè)到最低的熒光素酶信號(hào)，表明這種納米藥物有效地抑制了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性4T1腫瘤的生長(zhǎng)。H&E染色也證實(shí)了GM@LR對(duì)腫瘤抑制最大，細(xì)胞凋亡顯著(圖5D)。同時(shí)，GM@LR治療可顯著延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存時(shí)間(圖5E)，CD80+CD86+成熟DC在轉(zhuǎn)移瘤中的比例增加，腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞增加(圖5F,G)，瘤內(nèi)Treg減少(圖5H,I)?？偠灾?，GM@ LR通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)對(duì)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用。

綜上所述，該課題開(kāi)發(fā)了一種PEG-cRGD修飾脂質(zhì)體，包封MnCO和pGSDME，用于靶向治療TNBC。

PEG-cRGD表面修飾不僅提高了其穩(wěn)定性，而且增強(qiáng)了其靶向腫瘤的能力。在內(nèi)源性高水平H2O2存在的4T1細(xì)胞中，被包裹的MnCO分解為Mn2+和CO，導(dǎo)致caspase-3激活。活化的caspase-3裂解全長(zhǎng)GSDME誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終釋放出大量的DAMPs。此外，Mn2+通過(guò)激活TIDC中的cGAS-STING通路增強(qiáng)了凋亡觸發(fā)的抗腫瘤反應(yīng)。這些協(xié)同作用顯著抑制了原位和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。

本研究提供了一種可能的策略，通過(guò)焦亡和cGAS-STING信號(hào)激活誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，同時(shí)結(jié)合免疫治療和MRI診斷。

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文獻(xiàn)原文

https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01008

原文引用

“GSDME plasmid and GFP plasmid were established by

Genomeditech (Shanghai, China)Co.,Ltd (Shanghai, China).The mouse GSDME plasmid(gene ID: NM_018769.4) was established by Genomeditech (Shanghai) with the vector pcDNA3.1(+).”