寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院團(tuán)隊(duì)在2016年3月15日發(fā)表于Development（IF：5.596，JCR 2區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Xiao-Fan Zhao教授，研究表明在棉鈴蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中，20-羥基蛻皮甾酮（20E）通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)來(lái)激活FoxO從而促進(jìn)蛋白水解。

研究背景

????????FoxO在各種細(xì)胞的生理過(guò)程中具有不同功能，包括調(diào)控大鼠交感神經(jīng)元凋亡基因的表達(dá)、果蠅的細(xì)胞分化和小鼠骨骼肌的自噬。FoxO的活性在胰島素（insulin）途徑中被抑制。在insulin調(diào)節(jié)下，F(xiàn)oxO被Akt磷酸化并維持在細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)阻斷該通路時(shí)，F(xiàn)oxO不會(huì)被磷酸化而是轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。PTEN是insulin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，其功能是抑制Akt的磷酸化。

????????FoxO的表達(dá)可被類(lèi)固醇激素20-羥基蛻皮甾酮（20E）上調(diào)。20E誘導(dǎo)FoxO的高表達(dá)與核定位，從而在家蠶蛻皮和蛹化期間上調(diào)brummer和酸性脂肪酶-1的表達(dá)，并促進(jìn)脂肪體細(xì)胞的脂解。較高濃度的20E會(huì)抑制棉鈴蟲(chóng)中胰島素誘導(dǎo)的基因表達(dá)。在果蠅中，F(xiàn)oxO與USP相互作用以介導(dǎo)蛻皮激素的生物合成。這些研究表明20E可通過(guò)激活FoxO誘導(dǎo)蛻皮和變態(tài)過(guò)程，但其中的分子機(jī)制尚不清楚。

摘要部分

????????本研究旨在確定20E對(duì)FoxO活性的調(diào)控機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)，在棉鈴蟲(chóng)蛻皮和變態(tài)過(guò)程中，20E促進(jìn)了FoxO的表達(dá)，而FoxO的敲低抑制了幼蟲(chóng)的蛻皮和20E調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明，20E通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)抑制了胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化，從而抑制FoxO磷酸化以及誘導(dǎo)FoxO的核定位。在細(xì)胞核中，F(xiàn)oxO直接調(diào)控BrZ7的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)蛻皮過(guò)程中羧肽酶A（CPA）的表達(dá)。因此，F(xiàn)oxO是蛻皮過(guò)程中20E誘導(dǎo)蛋白水解的關(guān)鍵調(diào)控因子。

研究?jī)?nèi)容

1.20E在蛻皮和變態(tài)過(guò)程中誘導(dǎo)FoxO的表達(dá)

????????作者首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出棉鈴蟲(chóng)的FoxO基因，分析發(fā)現(xiàn)其基因序列相對(duì)保守。然后作者檢測(cè)了FoxO在棉鈴蟲(chóng)的表皮、中腸和脂肪體的表達(dá)譜。結(jié)果顯示，與攝食期相比，這些組織中的FoxO蛋白水平在蛻皮期和變態(tài)期明顯升高。此外，作者將20E注射到六齡6h幼蟲(chóng)體內(nèi)，觀察到了FoxO轉(zhuǎn)錄本的增加。相比之下，juvenile激素III（JH III）不能誘導(dǎo)FoxO。因此20E在棉鈴蟲(chóng)蛻皮和變態(tài)期間上調(diào)了FoxO的表達(dá)。

研究結(jié)論：FoxO可能被20E誘導(dǎo)表達(dá)從而參與蛻皮和變態(tài)過(guò)程。

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2.FoxO的敲低抑制幼蟲(chóng)蛻皮以及20E通路的基因表達(dá)

????????為探究FoxO的功能，作者將FoxO dsRNA（dsFoxO）注入五齡6h幼蟲(chóng)中以下調(diào)FoxO表達(dá)。實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)oxO的敲低不會(huì)影響20E核受體EcRB1和USP1的表達(dá)，但顯著抑制了轉(zhuǎn)錄因子BrZ7和CPA的表達(dá)。另外，F(xiàn)oxO敲低也明顯阻礙了幼蟲(chóng)的蛻皮。統(tǒng)計(jì)表明，當(dāng)沉默F(xiàn)oxO時(shí)，62％的幼蟲(chóng)未能脫落舊表皮進(jìn)入第六齡期，并最終死亡。

?????????作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FoxO被敲低時(shí)，皮層溶離無(wú)法發(fā)生且舊的角質(zhì)層不能從表皮中分離。此外，在dsGFP對(duì)照組的老表皮和表皮中檢測(cè)到CPA蛋白，而在dsFoxO處理的幼蟲(chóng)表皮中未能檢測(cè)到CPA蛋白。這表明FoxO通過(guò)調(diào)控CPA表達(dá)以實(shí)現(xiàn)蛋白水解。

?研究結(jié)論：FoxO通過(guò)調(diào)控20E通路中EcRB1和USP1下游的BrZ7和CPA的表達(dá)，從而在蛻皮過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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3.20E抑制HaEpi細(xì)胞中FoxO磷酸化并調(diào)控FoxO的核定位

????????作者通過(guò)免疫組化探究了表皮中FoxO的亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與5F相比，5M和變態(tài)期的表皮在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能檢測(cè)到FoxO，且其在細(xì)胞核中的水平增加。另外，蛋白印跡顯示了上下兩條FoxO條帶，5F階段時(shí)上帶占優(yōu)勢(shì)，而5M和6-72h時(shí)下帶占主導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)表明，上帶是FoxO的磷酸化形式。磷酸化的FoxO分布在細(xì)胞質(zhì)中，而非磷酸化的FoxO分布在細(xì)胞核中。

?????????作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO與20E孵育6h后，其在細(xì)胞核中的定位增加。蛋白印跡證實(shí)了20E孵育后細(xì)胞核中非磷酸化的FoxO增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，饑餓條件下的FoxO主要定位于細(xì)胞核，胰島素的添加使FoxO從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。然而，添加20E后，F(xiàn)oxO顯示出越來(lái)越多的核定位。

研究結(jié)論：FoxO在進(jìn)食階段主要被磷酸化并位于細(xì)胞質(zhì)中，而在蛻皮和變態(tài)階段主要被去磷酸化并位于細(xì)胞核中。另外，20E可以抑制FoxO磷酸化并誘導(dǎo)FoxO定位于細(xì)胞核。

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4.20E抑制Akt磷酸化以降低FoxO的磷酸化

????????為揭示20E抑制FoxO磷酸化的機(jī)制，作者分析了Akt在胰島素誘導(dǎo)FoxO磷酸化中的作用。WB顯示胰島素在15min內(nèi)誘導(dǎo)了FoxO的磷酸化。然而，Akt的敲除顯著抑制了胰島素誘導(dǎo)的FoxO磷酸化。這表明胰島素通過(guò)Akt誘導(dǎo)FoxO磷酸化。當(dāng)胰島素誘導(dǎo)FoxO磷酸化時(shí)，也會(huì)誘導(dǎo)Akt磷酸化。反過(guò)來(lái)，當(dāng)20E抑制胰島素誘導(dǎo)的FoxO磷酸化時(shí)，Akt磷酸化也被抑制。

?研究結(jié)論：20E抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化，從而抑制FoxO磷酸化

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5.20E通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)來(lái)抑制Akt磷酸化

????????接下來(lái)作者探究了PTEN在20E抑制Akt磷酸化中的作用。實(shí)驗(yàn)顯示，蛻皮變態(tài)過(guò)程中Akt的磷酸化降低，PTEN表達(dá)增加。20E誘導(dǎo)3h后PTEN表達(dá)上調(diào)，此時(shí)Akt未被磷酸化。進(jìn)一步研究表明，20E直接調(diào)控PTEN表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)，敲低EcRB1或USP1顯著降低了20E誘導(dǎo)的PTEN表達(dá)。這說(shuō)明20E通過(guò)EcRB1和USP1上調(diào)PTEN表達(dá)。此外，敲除PTEN時(shí)，20E不能抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化。

?研究結(jié)論：20E通過(guò)促進(jìn)PTEN表達(dá)抑制了Akt磷酸化。

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6.FoxO在20E誘導(dǎo)過(guò)程中直接調(diào)控BrZ7的轉(zhuǎn)錄? ?

????????作者在BrZ7基因的上游區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)FoxOBE序列（5′-TTGTTTAA-3′）。ChIP顯示，在轉(zhuǎn)染空載的免疫沉淀物中檢測(cè)到少量含有FoxOBE的DNA片段。相反，在20E誘導(dǎo)的pIEx-4-FoxO-GFPHis轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫沉淀物中獲得了大量含有FoxOBE的DNA片段，但DMSO或JH III孵育的細(xì)胞中沒(méi)有獲得。進(jìn)一步分析表明FoxO在20E誘導(dǎo)過(guò)程中與BrZ7的近端啟動(dòng)子區(qū)特異結(jié)合。

????????從DMSO處理的細(xì)胞中分離的FoxO被磷酸化，但從20E處理的細(xì)胞中分離的FoxO未被磷酸化。為了證實(shí)非磷酸化的FoxO直接與FoxOBE結(jié)合，作者用地高辛（Dig）標(biāo)記的FoxOBE探針和FoxO-GFP-His蛋白進(jìn)行EMSAs實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示DMSO處理的細(xì)胞中FoxO-GFP-His并沒(méi)有移動(dòng)探針。然而，20E誘導(dǎo)的細(xì)胞中FoxO-GFP-His被檢測(cè)到一個(gè)明顯的位移。此外，當(dāng)未標(biāo)記的FoxOBE探針用作競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)，探針與FoxO-GFP-His的結(jié)合力降低。

?研究結(jié)論：非磷酸化的FoxO與BrZ7的FoxOBE結(jié)合，從而直接調(diào)控BrZ7的轉(zhuǎn)錄。

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7.20E調(diào)控的級(jí)聯(lián)基因表達(dá)

????????為研究20E誘導(dǎo)過(guò)程中的級(jí)聯(lián)基因表達(dá)，作者分別敲低了EcRB1、USP1、FoxO和BrZ7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HaEpi細(xì)胞中敲低EcRB1或USP1可以抑制20E誘導(dǎo)的FoxO、BrZ7和CPA的表達(dá)。敲低FoxO抑制了BrZ7和CPA表達(dá)，但沒(méi)有抑制EcRB1和USP1的表達(dá)。BrZ7的敲低可以抑制CPA表達(dá)，但不能抑制FoxO表達(dá)。

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?研究結(jié)論：20E通過(guò)EcRB1和USP1上調(diào)FoxO表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BrZ7表達(dá)，最終誘導(dǎo)CPA表達(dá)。

結(jié)論與討論

????????研究表明，胰島素誘導(dǎo)Akt磷酸化，然后Akt誘導(dǎo)FoxO的磷酸化和細(xì)胞質(zhì)定位，從而促進(jìn)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)并產(chǎn)生更多20E。然而高水平的20E會(huì)通過(guò)EcRB1和USP1上調(diào)PTEN和FoxO的表達(dá)。PTEN抑制Akt的磷酸化.從而抑制FoxO磷酸化。非磷酸化的FoxO會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并直接與BrZ7上游區(qū)域的FoxOBE結(jié)合以誘導(dǎo)BrZ7轉(zhuǎn)錄。最終,BrZ7通過(guò)調(diào)控CPA表達(dá)促進(jìn)蛻皮過(guò)程中的蛋白水解。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1242/dev.128694