作為泌尿系統(tǒng)中最重要的器官，腎臟在血液循環(huán)系統(tǒng)中承擔著濾過排出代謝物并重吸收水和營養(yǎng)物質(zhì)的重要責任。腎臟也具有內(nèi)分泌功能，可生成腎素、促紅細胞生成素、激肽等。腎單位是組成腎臟的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，包括腎小體和腎小管。腎小體內(nèi)有一個腎小球，它由腎動脈分支形成。腎小球外有腎小囊包繞。腎小囊分兩層，兩層之間有囊腔與腎小管的管腔相通。腎小管匯成集合管，若干集合管匯合成乳頭管，尿液由此流入腎小盞。

腎臟中有20多種不同的細胞類型，腎小體的主要細胞包括由構(gòu)成球內(nèi)毛細血管的內(nèi)皮細胞、構(gòu)成腎小囊的上皮細胞、囊壁反折包裹毛細血管形成的足細胞、及連接毛細血管的球內(nèi)系膜細胞等；腎小管主要由腎小管上皮細胞構(gòu)成。多種細胞類型和復雜的結(jié)構(gòu)是阻礙腎臟基因治療的阻礙，因此，有效的基因傳導是該器官分子治療成功的關(guān)鍵。

AAV作為基因遞送的重要載體之一，具有高安全性和物種兼容性。針對不同組織和不同細胞選擇合適的血清型、特異性啟動子和注射方式有效提高AAV的感染效率，接下來，小編將和大家一起學習AAV在腎臟疾病研究中的靶向遞送策略。

重組AAV通過改變包裝質(zhì)粒中的cap基因來改變血清型，使其具有不同的組織趨向性或易感細胞類型。已有的研究表明AAV2、AAV6、AAV8、AAV9等血清型可有效感染腎臟內(nèi)某類或大部分細胞，而AAV8和AAV9型對腎臟不同細胞都具有較好的感染效果，使用最為廣泛的為AAV9血清型。

圖一所示通過左腎靜脈逆行注射將不同血清型AAV-Luc輸送至小鼠腎臟，1周至6個月不同時間點體內(nèi)熒光素酶表達量的變化顯示AAV8和AAV9型具有較強的表達。6個月后AAV6、AAV8和AAV9在腎臟如有較好表達。AAV9型可同時在髓質(zhì)和皮質(zhì)中保持較好的轉(zhuǎn)導效率。[1]

圖1. 不同血清型的AAV-Luc通過腎靜脈逆行注射感染腎臟

圖2. 不同血清型的AAV-GFP通過腎靜脈逆行注射感染腎臟

腎臟中細胞構(gòu)成復雜，盡管血清型在研究中可以選擇廣譜性啟動子CMV，也可以針對不同細胞選擇相應的特異性啟動子以獲得最佳感染效果，如感染腎臟足細胞可選擇Nphs1、Nphs2，感染腎小管上皮細胞可使用Ksp-cadherin、SGLT2等。

表一所列為漢恒生物提供的用于腎臟特異性表達調(diào)控的啟動子，并有試用裝可供試用，歡迎咨詢。

表1. 漢恒生物腎臟特異性啟動子

1.Nphs1足細胞特異性啟動子

Nphs1基因表達的正常分子為nephrin前體，在體內(nèi)通過蛋白分子糖，基化修飾等轉(zhuǎn)變?yōu)閚ephrin。NPHS1在廣泛的獲得性腎小球疾病中發(fā)現(xiàn)腎單位表達水平的改變，研究學者分離出一個1.25kB的最小啟動子區(qū)域，該區(qū)域可限制基因表達到腎小球基底膜和足細胞?！綪MID: 26015958】漢恒生物客戶在《Nature Communications》上發(fā)表的題為“Loss of CLDN5 in podocytes deregulates WIF1 to activate WNT signaling and contributes to kidney disease”的文章通過使用AAV9-Nphs1-Wif1原位注射腎臟，在足細胞上特異性過表達Wif1。[2]

圖3. 腎臟多點注射Nphs1啟動Wif1表達的AAV9?

2.Nphs2足細胞特異性啟動子

NPHS2的編碼產(chǎn)物腎小球蛋白（podocin）僅在足細胞中表達，其突變導致類固醇抵抗性腎病綜合征?；贜PHS2的基因表達特異性，Nphs2啟動子載體被設計并成功驅(qū)動外源基因在小鼠腎臟足細胞的特異性表達。研究者對小鼠尾靜脈注射攜帶Nphs2啟動子的AAV9，12周后的免疫染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導效率約為60%。[3]

圖4.?Nphs2驅(qū)動GFP在足細胞表達

3.Ksp-cadherin腎小管上皮細胞特異性啟動子

腎特異性鈣粘蛋白（Ksp-cadherin，Kspc）是鈣粘蛋白超家族的一種組織特異性成員，僅在腎小管上皮細胞的基底外膜中表達。研究者將Kspc啟動子應用于AAV上，小鼠尾靜脈注射兩周后GFP主要表達在腎小管。[4]

圖5. AAV9-Kspc-shALDH2特異性感染腎小管上皮

3

腎小球的選擇滲透性阻止大多數(shù)分子從血液進入腎臟，使用有效的注射方式是使病毒進入腎小球下游腎細胞的關(guān)鍵。尾靜脈注射AAV可感染部分腎小球細胞，而對下游腎小管細胞感染效率不佳。近年來，包括腎動脈注射、腎靜脈注射、經(jīng)輸尿管逆行給藥、腎實質(zhì)多點注射和腎盂注射等的局部給藥途徑被陸續(xù)開發(fā)，并廣泛應用于實驗動物腎臟組織的感染。[5]下表總結(jié)了相關(guān)的注射方式以及病毒用量，老師們可以根據(jù)需要進行選擇。

表2.

圖6. 腎臟的局部載體遞送方式

其中，腎實質(zhì)多點注射和腎盂注射為目前最常使用的一種注射方式。圖七所示為漢恒生物客戶發(fā)表于《Nature Communications》雜志上的題為“Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in male mice”的一篇文章，作者通過腎實質(zhì)多點注射（載體為HBAAV9-CMV-Neu1-3xflag-ZsGreen，病毒滴度1.5 × 10^12 vg/mL，注射5個點，10uL/點），成功感染小鼠腎實質(zhì)。[6]

其中，腎實質(zhì)多點注射和腎盂注射為目前最常使用的一種注射方式。圖七所示為漢恒生物客戶發(fā)表于《Nature Communications》雜志上的題為“Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in male mice”的一篇文章，作者通過腎實質(zhì)多點注射（載體為HBAAV9-CMV-Neu1-3xflag-ZsGreen，病毒滴度1.5 × 10^12 vg/mL，注射5個點，10uL/點），成功感染小鼠腎實質(zhì)。[6]

圖7.?NEU1在腎臟中過表達加重uuo誘導的腎纖維

圖八所示為漢恒生物客戶在《Acta Pharmacologica Sinica》雜志上發(fā)表的題為“Dihydroartemisinin suppresses renal fibrosis in mice by inhibiting DNA-methyltransferase 1 and increasing Klotho”的文章，使用AAV9通過腎盂注射法將shRNA輸送至腎臟組織，實現(xiàn)腎臟局部特異性敲低Klotho的目的（注射參數(shù)：載體為AAV9，病毒滴度2 × 10^12vg/mL，注射劑量為50uL）。[7]

圖8. Klotho基因在腎臟中敲低顯著加重UUO小鼠的腎纖維化

在相繼跟大家分享了神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪、心血管系統(tǒng)與腎臟的組織細胞特異性基因表達調(diào)控干貨知識后，我們的組織（細胞）特異性表達調(diào)控AAV干貨系列知識就要暫告一段落了，下期開始，將為大家推送熒光素酶相關(guān)的干貨知識，歡迎大家繼續(xù)訂閱關(guān)注！

參考文獻

[1] Rocca CJ, Ur SN, Harrison F, Cherqui S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 2014 Jun;21(6):618-28. doi: 10.1038/gt.2014.35

[2] Sun H, Li H, Yan J, Wang X, Xu M, Wang M, Fan B, Liu J, Lin N, Wang X, Li L, Zhao S, Gong Y. Loss of CLDN5 in podocytes deregulates WIF1 to activate WNT signaling and contributes to kidney disease. Nat Commun. 2022 Mar 24;13(1):1600. doi: 10.1038/s41467-022-29277-6

[3] Zheng W, Guo J, Lu X, Qiao Y, Liu D, Pan S, Liang L, Liu C, Zhu H, Liu Z, Liu Z. cAMP-response element binding protein mediates podocyte injury in diabetic nephropathy by targeting lncRNA DLX6-AS1. Metabolism. 2022 Apr;129:155155. doi: 10.1016/j.metabol.2022.155155

[4] Xu T, Guo J, Wei M, Wang J, Yang K, Pan C, Pang J, Xue L, Yuan Q, Xue M, Zhang J, Sang W, Jiang T, Chen Y, Xu F. Aldehyde dehydrogenase 2 protects against acute kidney injury by regulating autophagy via the Beclin-1 pathway. JCI Insight. 2021 Aug 9;6(15):e138183. doi: 10.1172/jci.insight.138183

[5] Corridon PR. Still finding ways to augment the existing management of acute and chronic kidney diseases with targeted gene and cell therapies: Opportunities and hurdles. Front Med (Lausanne). 2023 Mar 7;10:1143028. doi: 10.3389/fmed.2023.1143028

[6] Chen QQ, Liu K, Shi N, Ma G, Wang P, Xie HM, Jin SJ, Wei TT, Yu XY, Wang Y, Zhang JY, Li P, Qi LW, Zhang L. Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in male mice. Nat Commun. 2023 Mar 27;14(1):1713. doi: 10.1038/s41467-023-37450-8

[7] Zhou W, Chen MM, Liu HL, Si ZL, Wu WH, Jiang H, Wang LX, Vaziri ND, An XF, Su K, Chen C, Tan NH, Zhang ZH. Dihydroartemisinin suppresses renal fibrosis in mice by inhibiting DNA-methyltransferase 1 and increasing Klotho. Acta Pharmacol Sin. 2022 Oct;43(10):2609-2623. doi: 10.1038/s41401-022-00898-3