如何從總核糖核酸中分離出
什么是mRNA
mRNA是蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄本。它是在真核生物的細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的，并將特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生信息帶入細(xì)胞質(zhì)中。在核糖體的幫助下，它在翻譯過程中被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的主要轉(zhuǎn)錄本稱為前mRNA。
在轉(zhuǎn)錄后修飾期間，產(chǎn)生具有幾個特征的成熟mRNA分子，例如5′帽和聚（A）尾。特定生物體的總mRNA被稱為其轉(zhuǎn)錄組。
總RNA的組成是什么
RNA 分離的結(jié)果稱為總 RNA。它由細(xì)胞產(chǎn)生的所有三種主要類型的RNA組成。它們是磁共振、叔丁酸和右旋核酸。叔丁酸和右旋核酸都有助于翻譯。真核生物mRNA的大小為0.5-20 kb。轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）在翻譯過程中帶來相應(yīng)的氨基酸。它長76-90個堿基對，由抗密碼子區(qū)域組成，與mRNA上的特定密碼子互補。核糖體核糖核酸（rRNA）是核糖體的一種成分。一些人類 rRNA 的長度為 5 kb。
超過90%的總RNA由tRNA和rRNA組成。只有總RNA的1-5%是磁共振。典型的哺乳動物細(xì)胞可能由每個細(xì)胞約500，000個mRNA分子組成。特定類型的mRNA的量可以是每個細(xì)胞15-20，000個拷貝。
如何從總RNA中分離出mRNA
根據(jù)細(xì)胞類型從總RNA中分離mRNA有兩種主要方法：直接分離mRNA的方法和減去mRNA分離的方法。
直接分離
圖2：親和色譜
總RNA應(yīng)溶解在高鹽緩沖液中，并短暫加熱至65-70°C以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)。RNA分離的條件在市售的mRNA分離試劑盒中有所不同。然而，聚（A）-RNA或mRNA的制備由三個步驟組成。
聚（A）-RNA與連接到載體的寡核苷酸dT分子的雜交
洗去未結(jié)合的核糖核酸
在低嚴(yán)格條件下從寡核苷酸-dT/載體組合中洗脫聚（A）-RNA
減去分離多核糖核酸的方法
基于寡核苷酸 dT 的 mRNA 純化僅產(chǎn)生具有多（A） 尾部或成熟真核 mRNA 的 mRNA。因此，另一種稱為減法的方法可用于純化沒有聚（A）尾的mRNA。該方法可用于從酵母和細(xì)菌總RNA中分離mRNA。它也可用于從真核細(xì)胞中分離未成熟類型的mRNA以及成熟的mRNA。
總RNA與rRNA序列特異性、5′生物素標(biāo)記寡核苷酸探針雜交
去除 rRNA/5′-生物素標(biāo)記的探針復(fù)合物以及鏈霉親和素包被的磁珠
雜質(zhì)的純化和mRNA的洗脫。
