疫苗對(duì)于保護(hù)人類(lèi)免受長(zhǎng)期存在或新出現(xiàn)的傳染病威脅至關(guān)重要。然而，疫苗開(kāi)發(fā)滯后問(wèn)題對(duì)于全球公共衛(wèi)生仍是巨大的挑戰(zhàn)。通常，全病毒疫苗（如衰減或滅活疫苗）可直接將強(qiáng)毒病毒轉(zhuǎn)化為疫苗。但由于其存在免疫力降低、安全不確定性及制作耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，阻礙了它們的廣泛應(yīng)用。而持續(xù)出現(xiàn)的新病毒使安全有效的即用型疫苗成為疫苗研發(fā)的重要方向。

2023年3月23日，浙江大學(xué)唐?？?、王曉雨及軍事醫(yī)學(xué)研究院侯利華作為共同通訊作者在Nature Biomedical Engineering（IF=29.234）在線(xiàn)發(fā)表了題為“Immunization against Zika by entrapping live virus in a subcutaneous self-adjuvanting hydrogel”的研究結(jié)果，本研究展示了一種病毒包埋水凝膠（virus-entrapping hydrogel，命名為Vax），它由作為病毒捕獲劑和內(nèi)置佐劑的殼聚糖低聚物水凝膠（COS）以及作為穩(wěn)定劑和Ca2+來(lái)源的碳酸鈣納米顆粒 （Nano-CaCO3）組成。帶正電側(cè)鏈的殼聚糖支架可通過(guò)靜電相互作用有效地捕獲病毒，同時(shí)其自輔助特性可以通過(guò)激活模式識(shí)別受體（PRRs）來(lái)激活先天免疫反應(yīng)和細(xì)胞募集。因此水凝膠為病毒捕獲及抗原加工提供了炎癥微環(huán)境，這對(duì)淋巴結(jié)中的抗原呈遞起到了促進(jìn)作用，由于生發(fā)中心（GC）B細(xì)胞的擴(kuò)大和交叉呈遞的改善，最終激發(fā)了有效的體液和細(xì)胞免疫。在沒(méi)有任何預(yù)處理的前提下，直接包埋活性病毒作為安全且有效的疫苗，這對(duì)于新型的傳染病是一種很有前景的預(yù)防策略。值得注意的是，本研究使用了漢恒生物提供的腺病毒作為模型病毒。

圖1. 病毒包埋水凝膠（Vax）示意圖

下面我們一起來(lái)看看具體的研究結(jié)果：

本研究首先利用Ad5進(jìn)行模型病毒包埋水凝膠制作，通過(guò)溫度掃描研究了Vax的熱凝膠行為，即研究其在不同溫度下的力學(xué)性能，結(jié)果證實(shí)了Vax包埋病毒作為疫苗的可行性。同時(shí)檢測(cè)到其對(duì)Ad5封裝效率超過(guò)99%。為研究Vax包埋病毒作為疫苗的安全性，檢測(cè)37 ℃條件下Vax在體外和體內(nèi)對(duì)病毒的禁閉效應(yīng)，結(jié)果顯示在體外模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件及不同pH溶液中，Vax對(duì)病毒釋放都表現(xiàn)出限制作用；利用缺乏干擾素受體的IFNAR1-/-小鼠作為感染模型，分別皮下注射野生型寨卡病毒（WT/ZIKV）及由Vax包埋的ZIKV（Vax/ZIKV），結(jié)果顯示W(wǎng)T/ZIKV組小鼠血清及其他受測(cè)器官中均檢測(cè)到病毒血癥，且最終死亡率為50%；Vax/ZIKV組小鼠僅在注射部位檢測(cè)到病毒RNA積聚，且在4-8周內(nèi)完全清除，在其血清及受測(cè)器官中均未檢測(cè)到病毒血癥，最終存活率為100%，表明由Vax包埋的ZIKV無(wú)法建立全身性感染。而后通過(guò)向出生1天的BALB/c小鼠分別顱內(nèi)注射WT/ZIKV和Vax/ZIKV檢測(cè)其神經(jīng)毒性。感染W(wǎng)T/ZIKV的小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，接種后23 d死亡率為100%。而注射Vax/ZIKV的小鼠死亡率為0，僅出現(xiàn)輕微神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表明Vax包埋病毒具有良好的安全性。同時(shí)，還通過(guò)注射空Vax研究了其可能出現(xiàn)的毒性，結(jié)果表明在注射前期引起了急性炎癥，但并未增加小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的水平，且浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞數(shù)量也快速恢復(fù)了正常水平，另外注射后未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)細(xì)胞毒性變化。

以上結(jié)果表明Vax可有效地限制病毒感染，且在體內(nèi)表現(xiàn)出最小的毒性，證明了其作為疫苗的安全性能。

圖2. Vax的表征及安全性研究

本研究利用RNA測(cè)序技術(shù)探究了Vax對(duì)RAW 264.7細(xì)胞差異表達(dá)基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些PRRs的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生上調(diào)。為了進(jìn)一步揭示Vax對(duì)PRRs的影響，在使用小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞BMDC和RAW 264.7細(xì)胞與Vax共孵育后發(fā)現(xiàn)CR3、CD14以及TLR4顯著上調(diào)，表明Vax包埋病毒對(duì)PRR激活表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，Vax治療后激活了先天免疫反應(yīng)。而后又進(jìn)一步研究了Vax對(duì)促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和Ad5組相比，COS/CaCO3、COS/Ad5和Vax組的促炎細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)，表明COS對(duì)促炎反應(yīng)有積極作用。另外Vax對(duì)先天免疫應(yīng)答的刺激也促進(jìn)了趨化因子的產(chǎn)生，而趨化因子利于免疫細(xì)胞的募集。綜上結(jié)果，Vax激活了相應(yīng)的先天免疫反應(yīng)，且PPRs的刺激是其激活先天免疫反應(yīng)的機(jī)制之一，機(jī)體在Vax注射位置形成炎癥微環(huán)境，抗病毒防御。

圖3. Vax通過(guò)激活PRRs刺激局部先天免疫反

為評(píng)估Vax是否有助于細(xì)胞遷移，本研究采用了體外Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與其他實(shí)驗(yàn)組相比Vax處理的BMDCs遷移數(shù)量最多，表明趨化因子增強(qiáng)了細(xì)胞募集。另外，通過(guò)皮下注射將Vax注射到BALB/c小鼠的腹部右側(cè)，結(jié)果顯示Vax組較其他實(shí)驗(yàn)組募集了更多的細(xì)胞。通過(guò)H&E染色和掃描電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，注射部位募集的細(xì)胞大部分包埋在結(jié)節(jié)內(nèi)并保持正常的細(xì)胞功能。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析表明Vax募集的大部分為抗原呈遞細(xì)胞（APCs），能夠處理Vax中包埋的病毒。以上結(jié)果表明Vax可促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞在注射部位募集，Vax對(duì)抗原呈遞有促進(jìn)作用。

圖4. 注射Vax后免疫細(xì)胞的募集情況

為探究病毒和Vax在體外共同驅(qū)動(dòng)局部免疫反應(yīng)活化和抗原呈遞的作用，作者利用熒光標(biāo)記的Vax/Ad5與BMDCs共孵育，結(jié)果顯示Ad5和Vax在細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)為共定位，而對(duì)照組Ad5的攝取效率較低，表明Vax對(duì)細(xì)胞攝取病毒產(chǎn)生積極響應(yīng)。另外，在BMDCs攝取Vax后，Ad5和Nano-CaCO3的存在對(duì)細(xì)胞活化標(biāo)志物（CD80等）上調(diào)顯示出顯著的協(xié)同效應(yīng)。為了測(cè)試Vax環(huán)境下抗原生成的局部過(guò)程，作者在Vax中裝載了卵清蛋白（OVA），并分析了抗原肽通過(guò)BMDCs上MHC-I途徑的呈遞狀況。結(jié)果顯示Vax能夠促使細(xì)胞產(chǎn)生大量的高表達(dá)SIINFEKL-MHC-I+和CD11c+的BMDCs，反映局部DC活化和抗原呈遞。為評(píng)估注射包埋病毒的Vax是否能有效引發(fā)宿主細(xì)胞的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，本研究使用抗六鄰體抗體檢測(cè)Ad5的定位，結(jié)果顯示注射Vax的結(jié)節(jié)中Ad5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他組；通過(guò)Ad5-Luc的熒光素酶轉(zhuǎn)導(dǎo)效率反映病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，結(jié)果表明Vax包埋病毒注射組可保證較高的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，吞噬效率低和細(xì)胞浸潤(rùn)程度小的其他實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)為病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)活性受損。通過(guò)注射野生型病毒和Vax包埋病毒觀(guān)察注射位置病毒RNA水平及DC細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，結(jié)果表明Vax包埋對(duì)病毒有一定的儲(chǔ)存效應(yīng)，但一段時(shí)間后病毒會(huì)被原位清除。而在注射Vax后形成的結(jié)節(jié)內(nèi)可觀(guān)察到大量DC細(xì)胞的浸潤(rùn)，表明Vax包埋的病毒注射有效激活了宿主抗原呈遞的過(guò)程。

圖5. Vax驅(qū)動(dòng)局部免疫反應(yīng)活化和抗原呈遞的情況

確定注射Vax能有效地啟動(dòng)抗原呈遞后，作者繼續(xù)評(píng)估了單次接種疫苗的后續(xù)適應(yīng)性應(yīng)答。研究將含有ZIKV前膜-包膜蛋白的Ad5載體裝載至Vax（Ad5-prM-E-Vax）中，在第4 ~ 6周檢測(cè)到顯著增強(qiáng)的E蛋白特異性IgG反應(yīng)，且PRNT50滴度持續(xù)了6周，表明裝載病毒的Vax可增強(qiáng)體液免疫作用，具備免疫保護(hù)效力。接種2周后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到ZIK-E特異性CD4+和CD8+ T細(xì)胞增多。綜上結(jié)果，Vax提高了細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，表明APCs從結(jié)節(jié)遷移到淋巴結(jié)。

圖6. 接種Ad5-prM-E-Vax后的全身免疫反應(yīng)

為解析Vax增強(qiáng)淋巴結(jié)免疫反應(yīng)并作用于全身的機(jī)制，作者研究檢測(cè)了Vax在引流淋巴結(jié)（dLN）中啟動(dòng)抗原呈遞的能力。結(jié)果顯示接種Vax后dLNs中表達(dá)CD80+和CD86+ 的DCs數(shù)量顯著增加；為了測(cè)試dLNs中的抗原呈遞，注射裝載OVA的Vax（Vax/OVA），結(jié)果顯示表達(dá)MHC-II+和CD40+ DC細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，證實(shí)了DC細(xì)胞的活化成熟，有利于隨后T細(xì)胞的激活。此外，Vax增強(qiáng)了OVA肽在MHC-I上的呈遞，可以通過(guò)MHC-I途徑交叉呈遞抗原到CD8+ T細(xì)胞。因此，本研究使用OVA四聚體染色檢測(cè)接種后dLNs中CD8+ T細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示OVA-Vax使OVA四聚體+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量急劇增加，這有助于抗原特異性的細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答。

另外，本研究測(cè)試了Vax介導(dǎo)生發(fā)中心B細(xì)胞激活的能力，通過(guò)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GCs高水平表達(dá)Fas和N-糖基神經(jīng)氨酸（GL7抗體檢測(cè)）情況。分析顯示，Vax/Ad5組GC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較其他組成倍增加。切片結(jié)果顯示，在該實(shí)驗(yàn)組中觀(guān)察到高度組織的GC結(jié)構(gòu)，表明Vax對(duì)dLNs中B細(xì)胞的下游活化起促進(jìn)作用。綜上所述，Vax能夠通過(guò)增強(qiáng)交叉呈遞和GC激活來(lái)激活T細(xì)胞反應(yīng)和體液反應(yīng)。

圖7.淋巴結(jié)免疫活化檢測(cè)

最后，為了驗(yàn)證Vax將野生型病毒轉(zhuǎn)化為有效疫苗的可能性，本研究以ZIKV致病株為例，研究了Vax/ZIKV對(duì)致命ZIKV攻擊的體內(nèi)保護(hù)作用。4~6周齡IFNAR1?/?小鼠接受單次皮下疫苗接種。結(jié)果顯示與滅活ZIKV（iZIKV）相關(guān)組相比，Vax/ZIKV組小鼠產(chǎn)生更快、更高的ZIKV E特異性血清IgG反應(yīng)和中和滴度。皮下免疫后，所有組的小鼠在免疫后第29天感染W(wǎng)T ZIKV。結(jié)果顯示，與Vax/ZIKV組相比，iZIKV相關(guān)組小鼠體重顯著減輕。在Vax/ZIKV和Ad5-prM-E組小鼠未觀(guān)察到發(fā)病率和死亡率，而在其他組中觀(guān)察到約20-70%的死亡率。

綜上結(jié)果表明，將滅活的ZIKV添加到Vax中或在iZIKV中添加佐劑無(wú)法獲得與活病毒包埋至Vax等效的保護(hù)作用，顯示出Vax裝載活病毒與傳統(tǒng)疫苗佐劑技術(shù)和病毒滅活策略相比的優(yōu)勢(shì)?？傮w來(lái)說(shuō)Vax是一種安全的材料，基于此生產(chǎn)的疫苗在消除病毒傳染性的同時(shí)增強(qiáng)了機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)病毒到疫苗的轉(zhuǎn)化