精子質(zhì)量檢測是診斷男性不育的重要手段，精液的常規(guī)分析費時費力，檢測指標(biāo)單一，只能反映精子的形態(tài)特征和有限的功能，無法準(zhǔn)確且全面的反映精子質(zhì)量。將流式細胞術(shù)（FCM）用于精液檢查，可把定性的描述過渡到定量的研究，并可進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，大大提高了實驗結(jié)果的科學(xué)性，而且可對精液進行高通量、多參數(shù)分析，能J大的拓展精子學(xué)這個生殖方面的子領(lǐng)域。

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EXBIO SpermFlowEx Kit，基于流式細胞術(shù)精液檢測分析試劑盒各指標(biāo)參數(shù)的處理與分析如下：

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（一）精液中精子及白細胞計數(shù)

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白細胞是精液中常見的一種細胞。白細胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧，分泌一些細胞因子等途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致精子數(shù)量減少。研究發(fā)現(xiàn)，白細胞計數(shù)增高與精子參數(shù)(包括密度)的降低存在明顯相關(guān)性。FCM檢測是根據(jù)白細胞所表達的共同抗原，用結(jié)合熒光染料的單克隆抗體CD45標(biāo)記白細胞進行檢測，相比于直接鏡檢、過氧化物酶染色等其他檢測手段，F(xiàn)CM可準(zhǔn)確區(qū)分白細胞與生精細胞，操作簡便，結(jié)果可靠，且可進一步區(qū)分白細胞各亞群。

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操作步驟：

吸取50ul稀釋好的精液至試管中

加10ul CD45 PE-Cy5抗體溶液

混合樣品，在室溫下孵育20分鐘

加50ul熒光計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)液（首先，將標(biāo)準(zhǔn)液混合均勻，加幾滴到干凈的微管中，然后用移液器從微管中吸取精準(zhǔn)體積的標(biāo)準(zhǔn)液加到精子樣本管）

加5ml PBS，混合后上流式細胞儀

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（二）精子存活率

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PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，只有沒有活力的精子才會被碘化丙啶溶液染色。因此用FCM結(jié)合DNA熒光染料PI，可以反映出精子的存活率。

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操作步驟：

吸取50ul稀釋好的精液至試管中

加10ul PI溶液

混合均勻，在室溫下孵育20分鐘

加0.5mlPBS，混合后上流式細胞儀

結(jié)果

將測量數(shù)據(jù)可視化為前向散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC）點圖。 如圖3所示，在精子細胞周圍設(shè)門。然后在直方圖中可視化精子細胞（圖4），其中X軸表示PE-Cy5或PerCP通道中碘化丙啶的熒光強度。使用適當(dāng)?shù)拈T分離陽性和陰性精子細胞。 陰性群體代表有活力的精子，而PI陽性群體則代表無活力的精子。 精子的生存率由所有精子細胞中有活力的精子的百分比表示。

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（三）頂體完整性和頂端體蛋白的存在

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在受精過程中，哺乳動物剛射出的精子在體內(nèi)要經(jīng)過獲能和頂體反應(yīng)，才能穿入卵細胞并與其融合，完成受精。因此檢測精子的頂體狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。精子頂端體蛋白（intra-acrosomal protein），是一種在成熟精子的頂體膜上特異性表達的蛋白，該蛋白在幾乎所有人類精子樣本中都能被檢測到，且表達量穩(wěn)定。利用標(biāo)記了FITC熒光素的頂端體蛋白抗體，特異性地標(biāo)記在頂體膜上，其熒光強度可反映頂體大小，因此通過測定熒光強度可間接反映頂體結(jié)構(gòu)的完整性。

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操作步驟-頂體的完整性

吸取50ul稀釋好的精液至試管中

加1 ml PBS，混合后，150 g離心5分鐘，去上清

再洗一次（重復(fù)步驟2）

向沉淀中加10ul Intra-acrosomal protein ?FITC抗體

混合均勻，在室溫下孵育20分鐘

加0.5mlPBS，混合后上流式細胞儀

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操作步驟-是否存在Intra-acrosomal protein（需透化）

吸取50ul稀釋好的精液至試管中

加1 ml滲透液

混合均勻，室溫下孵育15分鐘

150 g離心5分鐘，去上清液

向沉淀物中加入1 ml PBS，混合均勻，以150 g離心5分鐘

再洗一次（重復(fù)步驟5）

加入10 ul Intra-acrosomal protein ?FITC抗體

充分混勻，室溫下孵育20分鐘

加5mlPBS，混合后上流式細胞儀

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結(jié)果：

可視化抗體（頂端體蛋白FITC）對可滲透和未滲透樣品染色的前向散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC）點圖，并在精子周圍設(shè)門，如圖3所示。然后在直方圖中可視化精子事件（見圖5-7），其中X軸表示熒光強度 在FITC熒光檢測器中。 使用適當(dāng)?shù)拈T將陽性和陰性精子分開。 圖5顯示了陽性精子含量低（<30％）的未透化非病理性精子事件。 陰性代表具有完整頂體的精子，陽性代表具有受損的頂體的精子。圖6顯示了滲透性非病理性精子，其中陽性精子占主導(dǎo)地位。 陽性精子表明存在頂端體蛋白。圖7顯示了未滲透的病理性精子，其中頂體受損的陽性精子的含量高（> 30％）。

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精液檢測分析試劑盒鏈接：

https://www.amyjet.com/brand/EXBIO.shtml