doi:?10.3389/fonc.2022.654449

摘要：肝細胞癌（HCC）是最常見和最致命的肝癌類型。自噬是將受損或老化的細胞成分轉(zhuǎn)運到溶酶體中進行消化和降解的過程。越來越多的證據(jù)表明自噬是腫瘤進展的關鍵因素。本研究的目的是確定一組新的肝癌自噬相關預后標志物。

實驗方法：

人體組織

從在溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（中國溫州）接受手術(shù)切除的患者中獲得了 20 對肝癌和匹配的正常鄰近組織樣本。本研究中分析的所有樣本的臨床病理學特征均確認為肝細胞癌。所有標本均在液氮中冷凍。倫理批準由醫(yī)院倫理委員會確認，并獲得每位患者的書面知情同意。

定量實時 PCR

使用 TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從組織中分離總 RNA。使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (RR036A, Takara Bio, San Jose, CA, USA) 進行逆轉(zhuǎn)錄。使用 SYBR? Green PCR Master Mix (RR036A, TAKARA Bio, USA) 使用 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 進行 PCR。表 S3列出了本研究中使用的引物。

細胞系和培養(yǎng)

人肝星狀細胞系LX2、正常肝細胞系L02和HCC細胞系MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3、Hep3B、PLC/PRF/5和Huh7獲自中國科學院細胞庫。將細胞在補充有 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素的 RPMI 1640 或 DMEM 中在 37°C 和 5% CO?2下培養(yǎng)。

細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)制造商的方案，使用 Lipofectamine 3000 (L3000008; Invitrogen) 用 FKBP1A 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。對數(shù)生長的細胞接種于 6 孔板中，待細胞融合至 70%~80% 時進行轉(zhuǎn)染。在 37°C 孵育 48 小時后，評估 FKBP1A 表達。

細胞計數(shù) Kit-8 檢測

轉(zhuǎn)染48小時后，將每組MHCC97H細胞以5000個細胞/孔的密度接種到96孔板中。每組設5個重復。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒（CK04，Dojindo，Kumamoto，Japan），并在培養(yǎng)0、24、48和72小時后檢測吸光度值。

菌落形成試驗

將處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染 MHCC97H 細胞以每孔 500-1,000 個細胞的密度接種在六孔板中。當單個細胞長成肉眼可見的菌落時，用 0.1% 結(jié)晶紫（Meilunbio，大連，中國）對細胞進行染色。使用倒置顯微鏡計數(shù)克隆數(shù)。

Transwell 檢測

使用 transwell 測定法確定細胞的遷移和侵襲能力。轉(zhuǎn)染 48 小時后，將 MHCC97H 細胞 (2 × 10?4?) 接種在涂有或未涂有 50 μl Matrigel (BD) 的 8 μm 孔聚碳酸酯膜（Corning Costar Corp, Corning, NY, USA）的上室中Biosciences, San Jose, CA, USA)。將含有 10% FBS 的 DMEM 作為化學引誘劑添加到下室。37℃孵育24 h遷移，48 h侵襲后，輕輕去除濾膜上表面的細胞，遷移至膜底部的細胞用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫溶液，200 倍顯微鏡下計數(shù)。對五個隨機視野中計數(shù)的細胞數(shù)進行平均。

傷口愈合試驗

將 HCC 細胞接種在六孔板中，并在含有 1% 胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用 100 μl 移液器吸頭刮擦細胞單層。然后使用顯微鏡（TS100-F，尼康，東京，日本）在受傷后 0、24、48 和 72 小時觀察傷口愈合情況并拍照。

動物異種移植模型

BALB/C裸鼠（18-20g）購自溫州醫(yī)科大學，動物實驗符合《動物實驗機構(gòu)倫理準則》。通過將用sh-FKBP1A或sh-NC轉(zhuǎn)染的MHCC97H細胞(1 × 10?6?/0.1 ml)皮下植入小鼠的右側(cè)進行異種移植。14天后，每2天檢查一次腫瘤生長情況，用公式V = 1/2（寬2×長）計算腫瘤體積。最后，將小鼠安樂死，并測量腫瘤組織的重量。

蛋白質(zhì)印跡分析

在 PMSF (Beyotime) 和 PhosSTOP (ROChe, Basel, Switzerland) 存在下，在 RIPA 緩沖液（Beyotime，Shanghai，China）中裂解總蛋白。根據(jù)標準程序進行蛋白質(zhì)印跡。針對 ATG5、ATG7 和 Beclin-1 的抗體購自 Abcam (Cambridge, UK)。針對 SQSTM1/p62 的抗體獲自 Proteintech (Rosemont, IL 60018, USA)。針對 LC3B、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 和 GAPDH 的抗體獲自 Cell Signaling Technology (CST, Danvers, MA, USA)。

免疫組化染色

按照標準方案對小鼠腫瘤組織的石蠟包埋切片進行免疫組織化學染色 (IHC)。使用了針對 Ki67 (Abcam) 和 LC3B (CST) 的抗體。代表性圖像由 Leica DM4000B 顯微鏡（德國耶拿）捕獲。

統(tǒng)計分析

使用 X-tile 3.6.1 軟件基于最小 p 值確定風險評分的截止點。使用 R 軟件進行統(tǒng)計分析。構(gòu)建受試者工作特征 (ROC) 曲線以估計風險評分的預后價值。等于或大于 0.7 的曲線下面積 (AUC) 值被視為顯著的預測值。

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差 (SD)。所有統(tǒng)計分析均使用 GraphPad 8 軟件進行。雙邊Student's t檢驗和ANOVA用于統(tǒng)計分析。p 值小于 0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

差異表達 ARGs 的鑒定

提取肝癌患者的 232 個 ARGs 的表達水平后，分別在 TCGA 和 ICGC 數(shù)據(jù)庫中鑒定出 32 個和 64 個差異表達的 ARGs。圖1）。此外，使用散點圖可視化了這兩個數(shù)據(jù)庫中 HCC 組織和正常組織之間差異表達的 ARGs 的表達模式。圖 2A、B）。構(gòu)建了一個維恩圖來識別 TCGA 和 ICGC 數(shù)據(jù)庫中差異表達的 ARGs（圖 2C）。最后，我們在兩個數(shù)據(jù)集中揭示了 22 個常見的差異表達 ARG，包括 3 個上調(diào)基因（DIRAS3、FOS 和 ITGA3）和 19 個下調(diào)基因（ATIC、BAK1、BAX、BIRC5、CANX、CAPN1、CAPNS1、CCL2、FKBP1A、 HSP90AB1、ITGA6、MAPK3、NAMPT、PARP1、PEA15、PRKCD、RPTOR、SPHK1 和 VAMP7）。

圖1

兩個數(shù)據(jù)庫中肝癌和正常肝組織之間自噬相關基因（ARGs）的差異表達。(A)火山圖和(B)?TCGA 數(shù)據(jù)庫差異表達 ARG 的聚類分析。(C)?ICGC 數(shù)據(jù)庫差異表達 ARGs的火山圖和(D)聚類分析。每個點代表一個基因。紅點代表顯著上調(diào)的 ARG，藍點代表顯著下調(diào)的 ARG。每列代表一個樣本，每一行代表一個基因。

差異表達 ARGs 的功能富集評估

使用 GO 和 KEGG 通路分析對這些差異表達的 ARG 進行功能富集分析，闡明了其生物學功能。圖 4,5）。最豐富的 GO 注釋與肽基絲氨酸修飾、蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)節(jié)和生物過程中的結(jié)合調(diào)節(jié)有關。細胞成分包括偽足、孔復合物和整合素復合物。術(shù)語 BH 域結(jié)合、SMAD 結(jié)合和伴侶結(jié)合是確定的前三個分子功能。豐富的 KEGG 通路與細胞凋亡、結(jié)直腸癌、志賀氏菌病、鉑類藥物耐藥性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工和其他通路顯著相關。大多數(shù)富集途徑的 Z 分數(shù)都小于零，表明它們中的大多數(shù)會降低。對于差異表達的 ARG，包括 IL-17 信號通路和 AGE-RAGE 信號通路在內(nèi)的 KEGG 通路顯示在熱圖中。

圖 5

京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 差異表達自噬相關基因 (ARGs) 通路富集分析。(A)圓圈顯示分配基因的 logFC 的每個術(shù)語的散點圖。紅色圓圈代表上調(diào)，藍色圓圈代表下調(diào)。(B)?ARGs 和通路之間關系的熱圖。每個塊的顏色取決于 logFC 的值。

預后性 ARG 的鑒定

我們使用單變量 Cox 回歸分析評估了從 TCGA 獲得的數(shù)據(jù)，以揭示患者預后與差異 ARG 表達譜之間的關系。14 個 ARGs 同時與肝癌患者的預后顯著相關（圖 6A）。然后，隨后進行了多變量 Cox 回歸分析（圖 6B）。最后，ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A 這五個基因被確定為 OS 的風險基因，并用于開發(fā)預后特征。此外，進行 Kaplan-Meier 分析以關注每個 ARG 的預后能力。TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明，ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A 的過表達與肝癌患者的較差 OS 密切相關。圖 6C）。桑樹圖譜結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1、H2AFX、LMNB1、POU5F1、TAT轉(zhuǎn)錄因子與5個基因相關（圖 6D）。此外，它們都調(diào)節(jié) FKBP1A 的表達。我們隨后進行了預后分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子 POU5F1 的高表達提示預后不良。圖 6E）。

預后風險模型的建立和定義

基于OS的預后風險評分公式構(gòu)建如下：風險評分=（0.5554×ATIC表達水平）+（-0.3096×BAX表達水平）+（0.2345×BIRC5表達水平）+（-0.3780×CAPNS1表達水平） +（0.5091 × FKBP1A 表達水平）。隨后，進行 X-tile 分析并確定 1.9 為 TCGA 集合中風險評分的最佳截止點（圖 7A-C）。使用根據(jù) TCGA 隊列中每位患者的風險評分計算的截止點，我們將他們分為兩組：高風險組和低風險組。TCGA數(shù)據(jù)集中患者的風險評分分布和生存狀態(tài)顯示在圖 7D.?接下來，熱圖顯示了五種風險 ARG 的表達譜（圖 7E）。我們觀察到高?；颊弑憩F(xiàn)出較高的風險基因（ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A）表達水平。從 ICGC 數(shù)據(jù)集獲得的結(jié)果相似（圖 7F，G）。

預后風險模型是肝癌的獨立預測因子

使用單變量和多變量 Cox 回歸模型來比較臨床參數(shù)和自噬相關風險評分模型的獨立預測值。在 TCGA 數(shù)據(jù)集中，單變量 Cox 分析顯示風險評分、腫瘤分期以及 T 和 M 分期與 HCC 患者的 OS 相關。圖 8A）。在多變量 Cox 回歸分析中，五基因風險評分與生存率顯著相關，而其他因素不顯著。圖 8B）。單變量和多變量 Cox 回歸分析均顯示，肝癌患者的風險特征、性別和腫瘤分期與 ICGC 數(shù)據(jù)集中的 OS 顯著相關。圖 8E、F）。這些結(jié)果證實，自噬相關預后模型獨立預測肝癌患者的生存。

TCGA集中每位患者的風險評分采用五基因風險評分公式計算。正如預期的那樣，風險評分根據(jù)最佳截止點將肝癌患者分為高危組和低危組，這些組的預后存在顯著差異。圖 8C）。高?；颊叩?OS 比低?；颊叨?。ICGC 數(shù)據(jù)集被視為獨立的外部驗證集，并使用相同的方法進行處理。Kaplan-Meier 分析再次證實了該特征的預后能力（圖 8G）。

使用基于 OS 的 ROC 曲線評估風險評分的預測性能。TCGA數(shù)據(jù)集中OS風險評分的AUC值為0.746，明顯高于年齡（AUC = 0.524）、性別（AUC = 0.504）、腫瘤分級（AUC = 0.501）、腫瘤分期（AUC = 0.678） )、T 期 (AUC = 0.679)、M 期 (AUC = 0.508) 和 N 期 (AUC = 0.508) (圖 8D）。ICGC數(shù)據(jù)集中簽名的AUC也高達0.744（圖 8H）?；谶@些數(shù)據(jù)，風險評分可有效預測肝癌患者的生存率。

FKBP1A在體外和體內(nèi)影響肝癌細胞的生物學行為

使用定量實時 PCR (qRT-PCR) 對來自相應 HCC 患者的 20 個腫瘤樣本和 20 個正常鄰近組織樣本進行了檢測。FKBP1A 和 CAPNS1 在腫瘤中的表達水平高于正常組織，但在 ATIC、BAX 和 BIRC5 的表達上沒有觀察到顯著差異。圖 9A和圖 S1?)。CPTAC數(shù)據(jù)庫用于分析肝癌患者FKBP1A蛋白的表達。在匹配的樣本中，F(xiàn)KBP1A 在肝臟腫瘤中的表達水平高于在鄰近組織中的表達（圖 S2）。此外，使用 qRT-PCR 將 FKBP1A 在六種 HCC 細胞系（MHCC97H、MHCC97L、HuH7、LM3、Hep3B 和 PLC）中的表達水平與人肝星狀細胞系 LX2 和正常人肝 LO2 細胞系中的表達水平進行了比較。 .?與 LX2 和 L02 細胞系相比，MHCC97H 細胞系中 FKBP1A 的表達顯著增加（?圖 9B）。對于隨后的研究，我們選擇了轉(zhuǎn)染 shRNA 的 MHCC97H 細胞系進行 FKBP1A 基因敲低實驗。選擇shFKBP1A-3組是因為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率大于70%（圖 9C）。我們進行了增殖、遷移和侵襲實驗，以評估 FKBP1A 在 HCC 細胞中的生物學功能。CCK-8 測定用于評估活力和細胞增殖，并顯示 FKBP1A 敲低顯著損害 MHCC97H 細胞生長。圖 9D）。一致地，集落形成試驗的結(jié)果表明，在 FKBP1A 下調(diào)后，細胞克隆的數(shù)量減少并且克隆形成的存活受到抑制。圖 9E）。進行 Transwell 測定以研究 FKBP1A 對侵襲和遷移的影響，這在癌癥進展中起重要作用。與 sh-NC 組相比，F(xiàn)KBP1A 表達的敲低阻礙了 HCC 細胞遷移和侵襲。圖 9F）。此外，還使用傷口愈合試驗評估了 sh-NC 和 sh-FKBP1A 組中 MHCC97H 細胞的遷移。FKBP1A 敲低顯著降低了細胞遷移的能力（圖 9G）。此外，我們檢測了 sh-FKBP1A在體內(nèi)MHCC97H 細胞腫瘤生長中的作用。正如預期的那樣，sh-FKBP1A 組的腫瘤大小、腫瘤體積和腫瘤重量顯著減弱。圖 9H-J）。因此，sh-FKBP1A在體內(nèi)和體外正向調(diào)節(jié)惡性腫瘤的行為。

FKBP1A 敲低增加 HCC 細胞和組織中的自噬水平

我們研究了 MHCC97H 細胞中 LC3B、p62、Beclin-1、ATG5 和 ATG7 的水平，以進一步發(fā)現(xiàn) FKBP1A 表達降低誘導自噬的分子機制。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP1A 敲低顯著增加了自噬標志物 LC3B-II、Beclin-1、ATG5 和 ATG7 的水平，并降低了 SQSTM1/p62 的水平。圖 10A）。然后，用自噬抑制劑氯喹預處理MHCC97H細胞，并使用Western印跡分析上述相關蛋白。如圖所示圖 10B, 氯喹逆轉(zhuǎn)了 sh-FKBP1A 誘導的 LC3B-II/LC3B-I 比率和 Beclin-1、ATG5 和 ATG7 水平的增加。用 sh-FKBP1A 處理后 p62 水平降低，氯喹也可逆轉(zhuǎn)。PI3K/AKT/mTOR 通路與自噬關系最為密切。我們評估了用或不用 sh-FKBP1A 轉(zhuǎn)染的 HCC 細胞中磷酸化 PI3K、AKT 和 mTOR 的水平，以確定 FKBP1A 介導的自噬調(diào)節(jié)是否可能涉及該信號通路。我們的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 sh-FKBP1A 的 MHCC97H 細胞中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 水平降低（圖 10C）。對轉(zhuǎn)染 sh-FKBP1A 的細胞施用氯喹，以進一步探索 PI3K/AKT/mTOR 通路參與 FKBP1A 介導的自噬。轉(zhuǎn)染 sh-FKBP1A 的細胞中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 的比率持續(xù)降低，而氯喹聯(lián)合處理則增加了這些比率。圖 10D)，表明 FKBP1A 誘導的 HCC 細胞自噬可能或至少部分由 PI3K/AKT/mTOR 通路介導。此外，使用 IHC 評估小鼠 HCC 腫瘤中 Ki-67 和 LC3B 的表達。我們發(fā)現(xiàn) sh-FKBP1A 抑制 Ki-67 的表達并增加 LC3B 的表達（圖 10E）。此外，HPA 數(shù)據(jù)庫用于分析 FKBP1A 的免疫組織化學染色。FKBP1A 在肝癌中的表達水平高于在正常肝組織中的表達（圖 10F）?？傊?，F(xiàn)KBP1A 敲低可能會阻止細胞增殖，但通過調(diào)節(jié) PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導自噬。

討論

HCC是最致命的人類癌癥之一。隨著肝癌臨床管理策略的發(fā)展，一些預后因素，包括腫瘤體積、分級、分期和病灶數(shù)量，已經(jīng)得到了表征（7、8）。然而，仍然迫切需要一種用于監(jiān)測HCC預后的有效分子生物標志物?；诓粩喾e累的新證據(jù)，自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關（9）。自噬機制的探索為肝癌的治療提供了新的前景。目前，高通量生物技術(shù)已廣泛應用于癌癥的早期診斷。因此，使用大規(guī)模數(shù)據(jù)庫將有助于探索 ARGs 的表達模式并揭示 HCC 患者的預后。

在目前的研究中，基于來自兩個數(shù)據(jù)集（TCGC 和 ICGC）的高通量表達數(shù)據(jù)，我們旨在篩選與 HCC 患者預后密切相關的關鍵 ARG。首先，22個ARGs在肝腫瘤和正常組織之間有差異表達，包括3個上調(diào)基因和19個下調(diào)基因。GO term 和 KEGG 通路分析結(jié)果顯示腫瘤生物學過程和分子功能顯著富集。GO富集分析結(jié)果表明，22個差異表達的ARGs與吞噬作用和細胞粘附有關。巨噬細胞的吞噬作用在 HCC 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。吞噬作用的抑制與 HCC 生長和轉(zhuǎn)移的風險增加有關，并且與 HCC 患者的總生存期縮短和無復發(fā)生存期相關。已經(jīng)表明，轉(zhuǎn)移增加與 HCC 患者的不良預后有關。細胞粘附系統(tǒng)的改變在肝外復發(fā)中起著核心作用。4）。在幾種類型的癌癥中鑒定了富集差異表達的 ARG 的 KEGG 途徑。因此，特定的自噬模式可能在肝癌的發(fā)生和進展中發(fā)揮作用。然后，我們在單變量生存分析中通過降維觀察了 TCGA 數(shù)據(jù)庫中與 OS 相關的 14 個風險 ARG。隨后的多變量生存分析確定了五個關鍵的預后 ARG（ATIC、BAX、BIRC5、CAPNS1 和 FKBP1A），用于構(gòu)建預后風險模型，為惡性肝腫瘤患者提供準確的預后。鑒定了與這五個基因密切相關的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子 POU5F1 可用于預測 HCC 患者的預后。預后風險模型和臨床參數(shù)的多因素Cox回歸分析表明，五基因風險評分有利于獨立預測肝癌患者的預后。同時，ROC曲線分析結(jié)果表明，預后風險模型準確地區(qū)分健康人和肝癌患者。

ATIC 是一種雙功能蛋白酶，催化嘌呤從頭生物合成途徑的最后兩個步驟。根據(jù)最近的研究，ATIC 在肺癌中的表達水平很高，并且與患者預后不良有關 (?10?)。很少有報道描述其在肝癌中的作用。HCC 中 ATIC 的上調(diào)與較短的生存期相關，并通過調(diào)節(jié) AMPK-mTOR-S6 K1 特征來支持 HCC 細胞的增殖 (?11?)。

BAX 已被證明是參與自噬的最廣泛表征的蛋白質(zhì)之一。它是 BCL2 蛋白家族的成員，通過與 BCL2 形成異二聚體而發(fā)揮凋亡激活劑的作用。Bax 參與線粒體啟動的內(nèi)在凋亡信號傳導和由跨膜死亡受體觸發(fā)的外在凋亡途徑 (?12?,?13?)。此外，BAX 影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 信號通路和線粒體通路之間的串擾 (?14）?？紤]到 Bax 在細胞凋亡中的重要作用，發(fā)現(xiàn) Bax 調(diào)節(jié)多種抗癌藥物誘導癌細胞凋亡的功效并不令人驚訝。SKA3 是紡錘體和動粒相關復合物的一種成分，通過調(diào)節(jié) HCC 細胞中的 BAX/BCL-2 表達來影響細胞凋亡 (?15?)。MT1G（一種對鋅離子具有高親和力的低分子量蛋白質(zhì)）對 p53 表達的調(diào)節(jié)導致 Bax 的上調(diào)，從而導致 HCC 細胞凋亡 (?16?)。

BIRC5 是凋亡抑制劑 (IAP) 家族的成員，可防止凋亡細胞死亡。BIRC5 通過促進增殖對 HCC 細胞發(fā)揮作用 (?17?)。近期研究表明，BIRC5應被視為HCC分子診斷和治療干預的潛在生物標志物，對HCC患者的預后有顯著影響(?18?,?19?)。

CAPNS1 是鈣蛋白酶小亞基家族的成員，作為異二聚體發(fā)揮作用，對鈣蛋白酶的活性和功能至關重要。多項研究表明，CAPNS1 在腫瘤發(fā)生中具有生物學功能。事實上，已經(jīng)在多種癌癥中檢測到 CAPNS1 表達，包括肝細胞癌 (?20?)、卵巢癌 (?21?)、結(jié)腸直腸癌 (?22?) 和鼻咽癌 (?23?)。體外實驗表明，CAPNS1 通過激活 FAK-Src 信號通路和 MMP2 促進 HCC 的生長和轉(zhuǎn)移 (?24?)。

FKBP1A 是一種順反式脯氨酰異構(gòu)酶，可與 FK506 和雷帕霉素結(jié)合并抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和 mTOR 活性 (?25?)。FKBP1A 被證實在 HCC 中過表達并預測預后不良 (?26?)。然而，F(xiàn)KBP1A 在 HCC 中的具體機制仍不清楚，值得進一步研究。

目前，F(xiàn)KBP1A在HCC中的具體分子機制仍未被廣泛了解。使用 TCGA 和 ICGC 數(shù)據(jù)庫，我們篩選了 5 個差異表達的 ARG，包括 FKBP1A，并建立了肝癌的預后模型。FKBP1A 在 HCC 組織中高水平表達，導致預后不良。相關轉(zhuǎn)錄因子分析表明，POU5F1可能調(diào)節(jié)CAPNS1和FKBP1A的表達，POU5F1的高表達與HCC患者預后不良有關。POU5F1 是一種干性相關轉(zhuǎn)錄因子，被發(fā)現(xiàn)可促進肝癌干細胞表型和癌癥轉(zhuǎn)移，并調(diào)節(jié) HBV 衍生 HCC 的特征基因的表達 (?27?,?28 )）。對 CPTAC 數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的分析表明，F(xiàn)KBP1A 在 HBV 相關的 HCC 中也有差異表達。該研究的主要發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)KBP1A 的表達不僅在公共數(shù)據(jù)庫中而且在我們收集的 HCC 組織中都顯著上調(diào)，表明 FKBP1A 可能是一個潛在的診斷標志物。一致地，F(xiàn)KBP1A 在 HCC 細胞系中過表達，表明 FKBP1A 可能在 HCC 發(fā)展中作為癌基因發(fā)揮作用。體外細胞功能測定證實，F(xiàn)KBP1A 敲低顯著改變了肝癌細胞的生物學行為，其下調(diào)降低了細胞增殖、遷移和侵襲。此外，F(xiàn)KBP1A 的缺失顯著抑制了裸鼠異種移植模型中 HCC 細胞腫瘤的生長。我們的數(shù)據(jù)還顯示，F(xiàn)KBP1A 的低表達通過PI3K/AKT/mTOR 通路在體外和體內(nèi)誘導自噬。

綜上所述，自噬與肝癌患者的預后密切相關。如本研究所示，風險 ARGs 是 HCC 潛在的候選預后生物標志物，在指導有關臨床治療選擇的決策中具有價值。同時，我們驗證了 FKBP1A 的臨床和功能意義，但需要進一步研究以闡明更詳細的機制。然而，我們研究的主要限制是我們使用了來自兩個公共數(shù)據(jù)庫的可用數(shù)據(jù)，上述結(jié)果需要在前瞻性研究中進一步調(diào)查。