下腰痛（Low back pain, LBP）是45歲以下患者活動受限的最常見原因，大約4/5的成年人都會遭受LBP的困擾，椎間盤退變（intervertebral disc degeneration, IVDD）是臨床上LBP的主要誘因。通過對IVDD發(fā)病機制領(lǐng)域的研究，發(fā)現(xiàn)其涉及衰老、DNA損傷，細胞凋亡等多方面因素，另外，最近有研究探索了circRNA在調(diào)節(jié)NPC細胞發(fā)揮的功能和IVDD進展中的機制[1-2]，同時能作為microRNA(miRNA)海綿發(fā)揮作用，也在小鼠退變的椎間盤模型中髓核central nucleus pulposus (NP)存在m6A甲基化修飾，但circRNA在調(diào)控IVDD發(fā)病的分子機制及具體的m6A甲基化修飾模式尚未明確。

2023年7月12日，復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院骨科王洪立/姜建元/鄒飛團隊在Cell Death & Differentiation（IF=12.4)發(fā)表文章“N6-methyladenosine hypomethylation of circGPATCH2L regulates DNA damage and apoptosis through TRIM28 in intervertebral disc degeneration”。結(jié)果顯示，作者在IVDD患者的中央髓核組織（central nucleus pulposus, NP)中發(fā)現(xiàn)circRNA m6A甲基化，并證明未甲基化的circGPATCH2L可以通過結(jié)合三結(jié)構(gòu)域蛋白28（tripartite motif containing 28, TRIM28）誘導(dǎo)DNA損傷積累和NPC細胞 凋亡，進一步加速IVDD的發(fā)展，甲基化修飾的circGPATCH2L可以招募核糖核酸內(nèi)切酶復(fù)合物YTHDF2-RPL10RNase P/MRP并進行核內(nèi)切，進一步維持NPC的生理狀態(tài)，為IVDD治療提供了潛在靶點。

1、未m6A甲基化的circGPATCH2L在退變髓核NP中上調(diào)

作者通過對IVDD組病例及對照組病例的NP組織進行m6A-circRNA表觀轉(zhuǎn)錄組芯片分析，檢測到4395個circRNA，經(jīng)過FC≥1.5，p≤0.5閾值過濾，有21/17個高/低circRNA甲基化，通過重疊m6A-circRNA表位轉(zhuǎn)錄微陣列分析/circRNA微陣列分析/qPCR鑒定和定量了13個共同差異的表達的circRNA。其中，hsa_circRNA_101411和hsa_circRNA_001409顯著上調(diào)，并用T3DNA連接酶檢測二者的甲基化狀態(tài)，與非m6A甲基化位點相比，發(fā)現(xiàn)IVDD組101411的m6A甲基化的連接效率顯著降低，將其命名為circGPATCH2L，并進行下一步研究。

2、circGPATCH2L在NPC中表達特征

作者通過PCR/qPCR/RNase R/FISH實驗進一步驗證它是可以擴增/R酶耐消化/定位于細胞核中，研究表明，一些circRNA具備ceRNA和翻譯功能，作者推測circGPATCH2L可作為蛋白質(zhì)的誘餌或者支架發(fā)揮作用。同時使用腫瘤壞死因子TNF-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）在體外發(fā)育遲緩模型中進行了敲低和回補實驗，通過過表達circGPATCH2L/si-circGPATCH2L/qPCR/雙染細胞凋亡檢測顯示circGPATCH2L過表達顯著增加了NPC細胞的分解代謝和細胞凋亡，而敲低circGPATCH2L在TNF-α處理后挽救了這些表型。

3、circGPATCH2L在NPC中潛在調(diào)節(jié)機制

為了進一步探索NP退變的分子機制，作者針對circGPATCH2L環(huán)化位點處設(shè)計生物素探針，利用 pulldown實驗拉下特異性結(jié)合的蛋白，并進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC–MS/MS)分析，鑒定到了三結(jié)構(gòu)域蛋白28（tripartite motif containing 28, TRIM28），TRIM28高度參與細胞DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response, DDR)。隨后用FISH/DNA損傷免疫熒光/彗星實驗檢測實驗，發(fā)現(xiàn)過表達circGPATCH2L增加了H2AX的磷酸化（γH2AX）的熒光強度，表明circGPATCH2L可以引發(fā)DNA雙鏈斷裂。并在過表達circGPATCH2L組里發(fā)現(xiàn)細胞核DNA碎片向陽極遷移，形成拖尾，表明DNA出現(xiàn)損傷，而在干擾TRIM28后，這種現(xiàn)象減弱。

在DNA損傷模型上用順鉑誘導(dǎo)進行了敲低和回補實驗，WB結(jié)果顯示circGPATCH2L抑制了TRIM28的磷酸化并增強了γH2AX的熒光強度。同時也促進P53和p-P53上調(diào)，circGPATCH2L敲低后P53和p-P53下調(diào)。由此得出circGPATCH2L參與了P53的降解和磷酸化。另外，TUNEL法細胞凋亡檢測也證實了circGPATCH2L在DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡調(diào)控中的作用。

為了研究circGPATCH2L和TRIM28在P53泛素化和降解中的調(diào)控作用，作者將si-circGPATCH2L和TRIM28過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入順鉑處理的NPC細胞中，導(dǎo)致P53泛素化增加，總P53減少。此外，在DNA損傷模型中使用蛋白酶抑制劑MG132檢查總P53的表達水平，在用順鉑處理的NPCs中，circGPATCH2L被干擾后，P53、p-P53及P53依賴性細胞凋亡相關(guān)蛋白均下調(diào)，再添加MG132后，凋亡相關(guān)基因表達水平增加。綜上所述，circGPATCH2L參與了NPC細胞的DNA損傷修復(fù)及細胞凋亡，其中TRIM28及P53發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

4、circGPATCH2L和TRIM28互作機制

作者進一步分析circGPATCH2L和TRIM28深層的互作機制，利用catRAPID算法來預(yù)測二者的互作位點，發(fā)現(xiàn)在TRIM28的510-561及402-452處氨基酸介導(dǎo)且互作緊密。p-TRIM28在DDR中起到關(guān)鍵作用，而過表達circGPATCH2L抑制了TRIM28磷酸化，作者接下來研究了TRIM28在Ser824位點的磷酸化是否依賴于circGPATCH2L與TRIM28的直接結(jié)合。

首先構(gòu)建了TRIM28-3×FLAG的shRNA標簽質(zhì)粒，包毒后產(chǎn)生了1個點突變及2個截短突變體。RNA pulldown 及RIP實驗表明Flag-rTRIM28-WT及MUT1與circGPATCH2L結(jié)合，表明在TRIM28的402-452氨基酸處互作較強。Co-IP實驗circGPATCH2L-TRIM28的結(jié)合不僅抑制了Ser824的磷酸化，而且還阻礙了TRIM28-MDM2相互作用。同時，為了探究兩者的互作是否影響NPC功能，WB顯示circGPATCH2L過表達降低了TRIM28的抗凋亡和DNA損傷修復(fù)作用，并促進了NPC的分解代謝。進一步證實了circGPATCH2L與TRIM28的402-452氨基酸處的結(jié)合來誘導(dǎo)NPC細胞的DNA損傷及凋亡，從而加速IVDD的進展。

5、RNase P/MRP在NPC中誘導(dǎo)YTHDF2介導(dǎo)的circGPATCH2L的m6A甲基化

作者發(fā)現(xiàn)circGPATCH2L在退行性NP組織中隨著m6A水平的降低而上調(diào)，推測circGPATCH2L的m6A水平可能影響其降解。同時發(fā)現(xiàn)m6A修飾過的circRNA通過核糖核酸內(nèi)切酶復(fù)合物YTHDF2-RPL10RNase P/MRP后核內(nèi)切裂解。首先，作者構(gòu)建了circGPATCH2L的WT及Mut突變載體，分別轉(zhuǎn)染NPC后，通過RNA pulldown及RIP實驗表明，circGPATCH2L通過m6A位點與YTHDF2結(jié)合。為了研究上述復(fù)合物在NPC中的功能，作者設(shè)計了針對這三種蛋白的siRNA，通過qPCR及WB驗證了敲低效率。并發(fā)現(xiàn)YTHDF2和RNase P/MRP 蛋白亞基 POP1下調(diào)后，circGPATCH2L表達豐度才會增加，推測m6A甲基化的circGPATCH2L可以被RNase P/MRP復(fù)合物切割，而不是以HRSP12依懶性方式切割。

為了進一步探索連接YTHDF2和POP1的骨架蛋白，通過兩個蛋白互作數(shù)據(jù)庫BioGrid和IntAct及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析得到4個候選的蛋白：CAND1、RPL10、CUL3和MKI67，通過si敲低驗證實驗，發(fā)現(xiàn)僅在RPL10下調(diào)后，circGPATCH2L的表達豐度才顯著增加。以及在過表達circGPATCH2L的NPC中使用生物素探針進行pulldown實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了YTHDF2、RPL10和POP1，但是沒有發(fā)現(xiàn)HRSP12，推測RPL10可能作為連接YTHDF2和POP1的骨架蛋白對circGPATCH2L進行裂解。同時YTHDF2、RPL10和POP1被下調(diào)后，NPC中circGPATCH2L、circGRB10和circERCC2的表達豐度顯著增加。綜上所述，m6A甲基化的circGPATCH2L可以在NPCs中被YTHDF2-RPL10-RNase P/MRP復(fù)合物進行核內(nèi)切。

6、circGPATCH2L在小鼠IVDD模型中功能機制

作者進一步在小鼠IVDD模型中研究了circGPATCH2L的功能，通過在小鼠的體內(nèi)腺病毒注射實驗，并在第2周及第4周進行X-射線造影/核磁共振/組織學(xué)染色，結(jié)果顯示：IVDD + Scramble組椎間盤高度下降，circGPATCH2L敲低后恢復(fù)椎間盤高度。同時，番紅-固綠染色及蘇木精-依紅染色顯示，IVDD + Scramble組纖維軟骨組織豐富，外纖維環(huán)破裂，同時IVDD + sh-circGPATCH2L挽救了這一表型。同時采用組織學(xué)分類評分系統(tǒng)檢測IVDD病情的進展，IVDD + sh-circGPATCH2L的組織學(xué)評分明顯低于IVDD + Scramble組。綜上所述，這些結(jié)果揭示了circGPATCH2L敲低后在小鼠模型中抑制ECM降解、恢復(fù)NP功能和緩解IVDD方面的積極作用。

總結(jié)

作者研究發(fā)現(xiàn)circGPATCH2L可以通過結(jié)合TRIM28作為蛋白誘餌參與IVDD的DNA損傷反應(yīng)和誘導(dǎo)細胞凋亡，可能是治療IVDD的潛在有效治療靶點。而且circGPATCH2L的m6A甲基化修飾能被核糖核酸內(nèi)切酶復(fù)合物YTHDF2-RPL10RNase P/MRP切割，以維持NPC細胞的穩(wěn)態(tài)，這也為circRNA在IVDD的潛在調(diào)節(jié)機制研究提供了重要的見解。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41418-023-01190-5

參考文獻：

[1] Li H, Tian L, Li J, Li Y, Du L, Huo Z, et al. The roles of circRNAs in intervertebral disc degeneration: inflammation, extracellular matrix metabolism, and apoptosis. Anal Cell Pathol. 2022;2022:9550499.

[2] Li Z, Chen X, Xu D, Li S, Chan MTV, Wu WKK. Circular RNAs in nucleus pulposus cell function and intervertebral disc degeneration. Cell Prolif. 2019;52:e12704.

[3] Chen LL. The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:475-90.