PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血單個核細胞，其主要細胞類型為血液里具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞（Ｔ＼Ｂ），單核細胞，吞噬細胞，樹突狀細胞和其他少量細胞類型，其中淋巴細胞占很大一部分。分離ＰＢＭＣ的主要目的是為了將多核細胞和紅細胞去除，從而能夠很方便地模擬體外的血液免疫環(huán)境。從血液制備PBMC是分離特定免疫細胞亞群之前常見的一個步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進行離心。

工具/原料

• 全血 （以10ml為例）

• 無菌PBS溶液(pH7.4)?或者生理鹽水

• 蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)

方法/步驟

1. ?將分離液用移液管從分離管嵌套的中心孔中加入：15ml的分離管需要加入約4ml分離液；50ml的分離管需要加入約13ml分離液，確保分離液覆蓋嵌套上方。

2. ?將抗凝樣本沿管壁緩慢倒入或用移液管沿管壁緩慢加入到分離管中。

3. ?室溫下離心10min，離心力為1200 x g。

4. ?收獲PBMC細胞，將分離管中上清倒入另一干凈離心管中，分離管中的嵌套能有效避免紅細胞和粒細胞再次污染。（注意：離心后傾倒收獲細胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于減少細胞被血小板污染。）

5. ?用PBS洗滌PBMC細胞，在250 x g離心力下離心10min。

6. ?按步驟5重復(fù)洗滌2次，用5ml PBS緩沖液重懸細胞。

注意事項

1. ?可用于人類外周血、骨髓和臍帶血樣本。不適用于血凝等異常樣本或超過48小時的樣本。

2. ?15ml的分離管建議使用4-9ml樣本；50ml的分離管建議使用13-30ml樣本。

3. ?對于放置24h以上的樣本，建議離心時間加長。

4. ?離心后收獲細胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于防止被血小板污染。

5. ?離心后傾倒上清時不要將分離管倒置2s以上。

6. ?分離管請勿重復(fù)使用。

7. ?離心后，細胞可能聚集在富集層以上的分離管的管壁上。這種聚合是正常的，受樣本質(zhì)量、樣本放置時間和抗凝劑類型的影響。此聚合與分離管的使用無關(guān)。細胞可以通過使用移液管尖端輕刮聚集團的一側(cè)來清除。