代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，文章標(biāo)題：Anthocyanin improves kidney function in diabetic kidney disease by regulating amino acid metabolism

發(fā)表期刊：Journal of Translational Medicine

影響因子：8.44

作者單位：中山大學(xué)附屬醫(yī)院

百趣提供服務(wù)：Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)、非靶向代謝組學(xué)

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享-研究背景

目前超過(guò)40%的糖尿病(Diabetes mellitus, DM)患者中會(huì)存在糖尿病腎病(Diabetic kidney disease, DKD)，DKD是慢性腎臟疾病最重要的病因之一。花青素(Antho-Cyanins, ANT)是存在于各種食物中的多酚類(lèi)化合物，在改善高血糖和胰島素敏感性方面發(fā)揮著重要作用。然而，目前ANT在DKD中的作用還知之甚少。本研究對(duì)DKD小鼠的腎臟和血清樣本進(jìn)行了Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)（百趣生物提供）的綜合分析，旨在評(píng)估ANT(cyanidin-3-O-glucoside [C3G])對(duì)DKD患者腎功能的影響，以及ANT的抗DKD作用是否與代謝途徑有關(guān)。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享-技術(shù)路線

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享-研究結(jié)果

1.ANT降低DKD小鼠體重和血糖水平并改善腎小球病變和纖維化

本研究構(gòu)建了3組小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停謩e為：CT組（對(duì)照組：12只db/m小鼠），DKD組（糖尿病腎病組：11只db/db小鼠）和ANT組（花青素處理組：11只db/db小鼠），然后作者研究了ANT對(duì)小鼠生化參數(shù)和腎組織病理學(xué)的影響。結(jié)果顯示，在第8~20周，DKD組小鼠的體重顯著高于CT小鼠，而在第15周后，ANT組小鼠體重顯著高于DKD組，在第8周后，DKD組小鼠空腹血糖水平明顯高于CT組，12周后，ANT可改善DKD組升高的空腹血糖水平。因此認(rèn)為ANT可以降低DKD的體重和空腹血糖水平。

腎切片H&E染色(Hematoxylin-eosin staining)顯示DKD組小鼠腎小球腫大，腎間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞充盈。與對(duì)照組相比，DKD組腎小球周長(zhǎng)和面積增加。而ANT處理后，腎小球、腎間質(zhì)腫大、炎癥細(xì)胞充盈的情況得到緩解，腎小球周長(zhǎng)減少。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，PAS染色(Periodic acid-schiff stain)顯示DKD組腎小球細(xì)胞增多，系膜擴(kuò)張。ANT治療后腎小球病變明顯緩解。腎組織馬松染色(Masson stain)顯示DKD組腎小球和腎間質(zhì)纖維化。然而，在ANT處理下，纖維化得到了改善。表明，ANT可以緩解DKD小鼠的腎小球病變和纖維化（圖1）。

圖1. 三組小鼠的生化參數(shù)和腎組織病理學(xué)特征

2.ANT對(duì)db/db小鼠蛋白表達(dá)譜的影響

基于Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，作者對(duì)CT組（6只小鼠），DKD組（6只小鼠）和ANT組（5只小鼠）的腎臟組織和血清樣本分別進(jìn)行了檢測(cè)。

在組織樣本中，一共鑒定出6355個(gè)蛋白質(zhì)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，其中，DKDvsCT組和ANTvsDKD組分別鑒定出712和3642個(gè)差異表達(dá)蛋白(Differentially expressed proteins, DEPs)。為了確定ANT在腎臟中調(diào)控的靶蛋白，作者首先對(duì)CT、DKD和ANT組進(jìn)行了STEM趨勢(shì)分析，并在樣例1、5、6、9、10和14中鑒定出了趨勢(shì)蛋白。ANT組中186個(gè)腎趨勢(shì)蛋白在DKDvsCT組和ANTvsDKD組中顯著差異表達(dá)，而ANT治療后可被抵消。在這些蛋白中，Mbl2(Mannose-binding protein C)、Cst3(cystatin C)和VAV1(Proto-oncogene vav)表達(dá)水平的升高可能會(huì)增加糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)Metascape網(wǎng)站分析，ANT組腎臟趨勢(shì)蛋白主要富集在代謝途徑中，包括羧酸、α-氨基酸、含堿基小分子、甘氨酸、天門(mén)冬氨酸家族氨基酸、細(xì)胞修飾氨基酸和β-丙氨酸代謝（見(jiàn)圖2）。

圖2. ANT對(duì)小鼠腎臟蛋白表達(dá)譜的影響

在血清樣本中，一共檢測(cè)到1673種蛋白質(zhì)，其中在DKDvsCT組和ANTvsDKD組分別鑒定出260和594個(gè)DEPs。作者觀察到ANT組中36個(gè)血清趨勢(shì)蛋白在DKDvsCT組和ANTvsDKD組之間有顯著差異表達(dá)，但在ANT治療后可以被抵消。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，在這些蛋白中，Plvap(Plasmalemma vesicle-associated protein)、Itgb2(Integrin beta-2)和Rbp4(Retinol-binding protein 4)可能與糖尿病腎小球病變的嚴(yán)重程度增加有關(guān)。通過(guò)Metascape網(wǎng)站分析，ANT血清趨勢(shì)蛋白在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、血漿脂蛋白顆粒組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞-底物粘附調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)和造血等方面均顯著富集（見(jiàn)圖3）。

圖3. ANT對(duì)小鼠血清蛋白表達(dá)譜的影響通過(guò)DKD組和CT組的比較，發(fā)現(xiàn)血清和腎臟樣本中共同檢測(cè)到31個(gè)DEPs，包括已知的糖尿病相關(guān)蛋白，如Serpina3k、Lpl、C1qb、Lgals3、Ctsd、Pdgfra、Apoc3、Apoc1、Lifr和Igfbp2，而在ANT組和DKD組血清和腎臟樣本中均檢測(cè)到178個(gè)DEPs。三組血清和腎臟中同時(shí)檢測(cè)到5個(gè)相同的DEPs(Capg、Pxdn、Mup20、Myh1和C8g)。相關(guān)性分析顯示，CT組、DKD組和ANT組中循環(huán)和腎組織蛋白之間無(wú)顯著相關(guān)性，提示ANT對(duì)腎蛋白和循環(huán)蛋白的治療作用是相互獨(dú)立的。

3.Db/db小鼠腎臟和血清代謝組學(xué)特征研究

作者比較了CT組和DKD組的腎臟和血清代謝組學(xué)。在腎臟和血清中，OPLS-DA模型顯示CT組和DKD組的代謝物分布有顯著差異。最終在CT組、DKD組腎臟和血清中分別鑒定出了228和171個(gè)DEMs。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)腎臟和血清中的DEMs分別有34條和23條通路顯著富集，主要涉及5類(lèi)代謝異常，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂類(lèi)代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝。進(jìn)一步，對(duì)兩組之間的通路活性進(jìn)行了GSVA分析。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腎臟中，花生四烯酸代謝被列為表達(dá)升高最明顯的途徑，而脂肪酸生物合成活性下降。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，許多氨基酸代謝通路活性表達(dá)顯著降低，包括組氨酸代謝、賴(lài)氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。輔助因子和維生素代謝途徑表達(dá)也顯著降低，包括煙酸鹽和煙酰胺代謝、維生素B6代謝、泛酸鹽和輔酶a生物合成。碳水化合物代謝途徑，包括肌醇磷酸鹽和β-丙氨酸代謝表達(dá)顯著降低。血清中賴(lài)氨酸降解途徑表達(dá)升高，DKD組腎臟和血清中其他氨基酸代謝途徑活性下降。強(qiáng)調(diào)了DKD發(fā)病機(jī)制中不同生物實(shí)體中代謝物的不同改變（見(jiàn)圖4）。

圖4. DKD患者腎臟和血清的代謝特征

4.ANT對(duì)db/db小鼠代謝表達(dá)譜的影響

作者在ANTvsDKD組腎臟和血清中最終分別鑒定出311個(gè)和282個(gè)DEMs。為了確定腎臟和血清中ANT調(diào)控的靶向代謝物，本研究對(duì)CT、DKD和ANT組代謝物進(jìn)行了STEM分析，并將樣例1、5、6、9、10和14中的代謝物確定為趨勢(shì)代謝物。進(jìn)一步分別對(duì)腎臟和血清中的46和47趨勢(shì)代謝物進(jìn)行層次聚類(lèi)分析。分別對(duì)腎臟中DKDvsCT、ANTvsDKD組以及趨勢(shì)代謝物中的228、311和46個(gè)DEMs進(jìn)行了分類(lèi)，觀察到“有機(jī)酸及其衍生物”類(lèi)豐富，“苯”類(lèi)稀少。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，分別對(duì)血清中171、282和47個(gè)DEMs進(jìn)行了分類(lèi)。發(fā)現(xiàn)在趨勢(shì)代謝物中，“有機(jī)雜環(huán)化合物”類(lèi)豐富，“核苷類(lèi)、核苷酸類(lèi)及類(lèi)似物”和“苯”類(lèi)很少。

圖5. ANT對(duì)小鼠腎臟和血清中代謝產(chǎn)物表達(dá)譜的影響

進(jìn)一步對(duì)肝臟中的46種趨勢(shì)代謝物進(jìn)行了GSVA分析，發(fā)現(xiàn)DKDvsCT組和ANTvsDKD組中，?；撬岷痛闻；撬岽x途徑均有顯著改變，該通路在DKDvsCT組間表達(dá)下調(diào)，在ANTvsDKD間表達(dá)上調(diào)。此外，對(duì)血清中47種趨勢(shì)代謝物進(jìn)行了GSVA分析。DKDvsCT組和ANTvsDKD組中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺生物合成途徑顯著改變。兩種通路在DKDvsCT之間表達(dá)上調(diào)，在ANT組和DKD組之間表達(dá)下調(diào)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，DKDvsCT組和ANTvsDKD組中色氨酸和酪氨酸代謝途徑也顯著改變。兩種通路在DKDvsCT之間下調(diào)，在ANTvsDKD組之間上調(diào)。作者觀察到ANT處理后色氨酸代謝途徑中，血清中l(wèi)-色氨酸和L-kynurenine下調(diào)，5-甲氧基吲哚乙酸和吲哚-3-乙醛上調(diào)。在酪氨酸代謝方面，ANT處理后馬來(lái)酸和富馬酸下調(diào)，吲哚5,6-醌上調(diào)（見(jiàn)圖6）。

圖6. 腎臟和血清中ANT趨勢(shì)代謝產(chǎn)物KEGG通路及被ANT改變的代謝通路的GSVA分析

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享-結(jié)論

綜上所述，該研究揭示了ANT在DKD中的多重改善作用，包括抑制空腹血糖、改善腎功能和腎臟組織病理學(xué)改變。通過(guò)采用Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)分析，探討了ANT減輕DKD腎臟損害的潛在機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，ANT有效地改變了db/db小鼠腎臟和血清的蛋白質(zhì)組和代謝表型。檢測(cè)到了先前研究中報(bào)道的許多DKD相關(guān)血清和腎臟蛋白，驗(yàn)證了本次的方法，同時(shí)觀察到ANT腎臟趨勢(shì)蛋白和代謝產(chǎn)物在氨基酸代謝中富集，主要在?；撬岷偷团；撬岽x中；ANT血清趨勢(shì)蛋白在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)中富集，ANT血清的趨勢(shì)代謝產(chǎn)物在色氨酸和酪氨酸代謝中富集。通過(guò)本文的研究表明食物中的ANT可能是一種潛在的氨基酸代謝調(diào)節(jié)劑，可以改善腎功能和腎臟形態(tài)。揭示了飲食中使用ANT預(yù)防和治療DKD的潛在臨床效果。